草質素對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脂肪變和肝內氧化應激的影響*

王 雨，王 楠，劉媛媛，李永勤，王巧俠，付建軍

草質素是從紅景天、筆筒草、棉花等植物中分離出的一種黃酮類物質[1-4]。草質素可以通過調節人肝癌細胞HepG2細胞活性氧介導的線粒體凋亡通路，促進癌細胞凋亡，達到抗癌的作用。草質素還具有較強的抗氧化能力，可以清除氧自由基和抑制蛋白質的氧化[5,6]。本研究采取高脂飲食誘導SD大鼠建立NASH模型，研究了草質素對動物肝內脂肪變性和氧化應激反應的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑與儀器 40只SPF級雄性SD大鼠購自湖北省武漢市疾病預防控制中心，6～8周齡【合格證號：SCXK(鄂)2011-0005】。 草質素(成都瑞芬思生物公司，純度≥98%)；基礎飼料、高脂飼料(武漢飼料公司)；檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血紅素氧化酶(HO-1)試劑盒(南京建成生物公司)；抗β-actin、抗Nrf2、抗細胞色素P450酶2E1(CYP2E1)和抗細胞色素P450酶4A(CYP4A，Santa生物公司)；RIPA裂解液、SDS上樣緩沖液、ECL發光液(碧云天生物公司)；BCA試劑盒(Thermo公司)；Cocktail(Roche生物公司)。臺式低溫高速離心機(Eppendorf公司)；iMARKTM酶標儀(BIO-RAD公司)；電子天平(Sartorius公司)；電熱恒溫水浴箱(精宏實驗設備有限公司)；旋渦混合器(其林貝爾公司)；電泳儀、垂直電泳槽、電轉儀(六一儀器廠)；Imager2000凝膠成像分析儀(Alpha Innotech公司)。

1.2 動物模型的制備 先用基礎飼料喂養動物于SPF級動物房1 w。將大鼠分為對照組，用基礎飼料喂食12 w，NASH模型組，用高脂飼料喂食12 w，小劑量草質素處理組，在喂食高脂飼料的同時，給予草質素20 mg·kg-1，灌胃處理12 w和大劑量草質素處理組，在喂食高脂飼料的同時，給予草質素40 mg·kg-1，灌胃處理12 w。實驗結束時，禁食12 h，經眼眶取血，斷頸處死動物，取肝臟。

1.3 肝勻漿生化指標檢測 取0.2 g肝組織，加生理鹽水1.8 ml，在冰水浴中勻漿，檢測TG、TC、FFA、MDA、SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性。

1.4 肝組織蛋白表達檢測 采用Western blotting法，取肝組織50 mg，加入裂解液0.5 ml，勻漿，冰上裂解30 min，將得到的液體以12000 g在4℃離心15 min，上清即為總蛋白。檢測蛋白濃度，每管分裝50 μg，水浴變性，溫度為100℃，處理10 min。用SDS-PAGE膠電泳，分離總蛋白，保留目標蛋白并電轉至PVDF膜，與特異性的一抗和二抗在37℃各孵育1 h，經ECL發光液顯色，分析結果。

2 結果

2.1 各組大鼠肝指數的變化 與對照組比，模型組體質量、肝質量和肝指數均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量藥物處理組肝質量和肝指數均顯著降低(P<0.05)，大劑量組體質量也顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質量、肝質量和肝指數比較

2.2 各組大鼠血生化指標比較 與對照組比，模型組大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC、FFA均顯著升高(P<0.05)；與模型組比，小劑量和大劑量草質素處理組大鼠血清ALT、AST、LDL-C、TG、TC和FFA水平均顯著降低(P<0.05，表2)。

表2 各組大鼠血生化指標比較

2.3 各組大鼠肝勻漿脂質含量比較 與對照組比，模型組大鼠肝勻漿TG、TC和FFA水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量組肝勻漿TG、TC和FFA水平顯著降低(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠肝勻漿脂質含量比較

2.4 各組大鼠肝勻漿氧化應激相關指標比較 與對照組比，模型組大鼠肝勻漿MDA水平升高(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量組肝勻漿MDA水平顯著降低(P<0.01)，而SOD、CAT、GSH-Px和HO-1水平顯著升高(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠肝勻漿氧化應激相關指標比較

2.5 各組肝組織蛋白表達情況比較 與對照組比，模型組大鼠肝組織Nrf2蛋白相對表達量降低(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相對表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組比，小劑量和大劑量草質素處理組肝組織Nrf2蛋白相對表達量升高(P<0.01)，而CYP2E1和CYP4A蛋白相對表達量降低(P<0.05，圖1)。

3 討論

草質素是紅景天屬的植物中主要的黃酮類化合物，紅景天是《神農本草經》中的上品，越來越多的研究證明紅景天中黃酮類物質的藥理活性比其中的苷類和多糖類更優，而紅景天黃酮類化合物最主要的藥理作用包括抗氧化、調節血脂和護肝作用[7-10]。

圖1 各組大鼠肝組織蛋白表達量比較與對照組比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比；*P<0.05，**P<0.01

因此，紅景天黃酮類物質在治療NASH方面有良好的前景。

本研究結果顯示，模型組血清FFA水平升高，可以反映出肝臟脂質堆積。應用草質素處理可以降低肝內脂肪堆積，說明草質素可以改善高脂飲食引起的肝臟脂肪變，緩解第一次打擊帶來的損傷[11,12]。肝臟MDA含量檢測結果顯示，高脂飲食會導致大鼠肝勻漿MDA含量增加，草質素可以降低模型組大鼠肝勻漿MDA含量，說明草質素可以緩解高脂飲食引起的氧化損傷。SOD、CAT、GSH-Px和HO-1是機體抗氧化防御系統最主要的組成成分，可以清除大部分的自由基，維持氧化系統的平衡[13-17]。高脂飲食會抑制SD大鼠肝臟SOD、CAT、GSH-Px和HO-1酶活性，同時給予草質素灌胃可以提高這些酶的活性，提高機體抗氧化能力。Nrf2是細胞內抗氧化還原反應最核心的調節因子，它不僅可以提高機體清除自由基的能力，還可以抑制自由基的生成。CYP2E1和CYP4A是主要生成自由基的酶系，與NASH患者體內氧化應激失衡有密切的關系[18]。本研究結果顯示高脂飲食會抑制Nrf2蛋白表達，而促進CYP2E1和CYP4A蛋白表達。給予草質素可以促進Nrf2的表達，抑制CYP2E1和CYP4A表達。根據這些結果，我們推測草質素可能主要是通過激活大鼠肝臟Nrf2表達，提高抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO-1活性，促進機體自由基的清除速度。抑制自由基生成酶CYP2E1和CYP4A的表達，抑制自由基產生，降低肝臟自由基含量，減緩脂質過氧化反應，降低了MDA含量，改善了氧化應激紊亂，緩解了第二次打擊的傷害[19，20]。