基于熒光碳點建立乳制品中四環素的快速檢測方法

文/何智燕 王蓓蓓

（揚州大學旅游烹飪學院）

乳制品安全是關乎健康的重大民生問題。四環素類抗生素是養殖業中常用的獸藥和飼料添加劑，具有抑菌范圍廣、殺菌能力強、成本低廉等優點，作為牛奶中常用的添加抗生素，其殘留問題受到人們的日益關注。長期食用含有四環素類抗生素的乳制品容易造成肝和腎臟的損傷，引發過敏和中毒反應，還會使牙齒變黃，嚴重影響人類的身體健康[1，2]。檢測四環素有很多種方法，但是大多數都比較繁瑣，其中ELISA可以對樣品進行直接檢測，但需要多次洗滌、加液、顯色等操作步驟；而膠體金免疫層析法檢測靈敏度只能達到50～100 μg/L[3]。

碳點是一種新型的碳基零維材料，具有優秀的光學性質、良好的水溶性、低毒性、環境友好、原料來源廣、成本低、生物相容性好等諸多優點。碳點大多具有sp2雜化碳的骨架結構，其表面帶有大量碳的含氧基團[4～7]（如羥基、羧基等），表現出優良的熒光性能，如耐光漂、非閃爍、發射波長可調、上轉換性能等。因此，可以和其他碳納米材料（碳納米管、石墨烯、富勒烯、納米金剛石等）在材料科學、生物化學、電子器件以及生物醫學等方面發揮同等重要的作用[8～10]。

在前人研究的基礎上，本文以L-型半胱氨酸、五氧化二磷和水反應合成熒光碳點（CDs），經離心獲得碳點溶液，以其作為熒光探針進行一定濃度的稀釋，在pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）緩沖溶液中，以檢測對象四環素對其有猝滅現象為機理，建立一種快捷、靈敏檢測微量四環素含量的熒光分析法。該試驗對四環素含量的測定方法，已初步應用在實際牛奶樣品的檢測中，且該方法具有操作簡單、選擇性高、試驗成本低、靈敏應用范圍廣等特點。

1 材料與設備

1.1 主要材料與試劑

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液（Tris-HCl）；四環素標準溶液。

1.2 儀器與設備

臺式離心機：科大創新股份有限公司；熒光分光光度計：上海棱光技術有限公司；紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 碳點的制備

分別稱取0.04 g L-半胱氨酸和2.50 g五氧化二磷置于潔凈的燒杯中，混合均勻，量取2.0 mL純水一次性加入該燒杯中，產生劇烈反應，爆出大量白煙后得到棕黃色、略有黑點的透明溶液，將其轉移置于離心機中離心（5 000 r/min，5 min），取上清液，放置一段時間，多次重復上述離心的上清液所得的碳點置于4 ℃冰箱中保存，用于進一步的鑒定和使用。

2.2 碳點的表征

在常溫條件下，取碳點原液置于比色皿中，在紫外-可見分光光度計中測定其紫外吸收光譜和熒光發射光譜。在測碳點溶液熒光光譜時，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，掃描電壓為900 V，掃描速度為1 000 nm/min，激發波長為380 nm。在上述條件下，改變激發波長（310～390 nm），測定不同激發波長下對應碳點的熒光光譜。

2.3 四環素猝滅熒光碳點的反應機理探討

2.3.1四環素對熒光碳點的初步測量

在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點溶液和1.0×10-4mol/L的四環素溶液，以不添加四環素的碳點溶液為空白對照，于熒光分光計中檢測，觀察添加四環素碳點溶液的熒光變化。

取等量的碳點溶液，分別加入不同濃度的四環素溶液，置于紫外燈下觀察不同濃度的四環素對碳點熒光的猝滅情況。

2.3.2不同濃度的四環素對碳點的熒光猝滅情況檢測

在pH值7.4的PBS中，加入一定濃度的碳點溶液，再加入不同濃度的四環素溶液，經反應一定時間后，檢測碳點的熒光猝滅情況。以不加四環素的碳點溶液為對照組。

2.4檢測條件的優化

2.4.1體系中pH值的優化

為確定體系的最佳反應pH值，在最佳的碳點使用濃度和反應時間下進行pH值的優化，即在pH值6.6、7.0、7.2、7.4、8.0下，分別檢測體系熒光變化量。

2.4.2反應時間的優化

為確定該體系的最佳反應時間，在最佳的碳點使用濃度和pH值下，配制5組體系，前4組每隔5min檢測1組體系，后1組每隔15min檢測1次，最終測得5組的熒光改變量。

2.4.3反應溫度的優化

為確定體系的最佳反應溫度，在最佳的碳點使用濃度、pH值和反應時間下，配制 5 組體系，每組體系的溫度分別設為0 ℃、5 ℃、15 ℃、25 ℃、50 ℃，分別檢測各組熒光改變量。

3 結果與分析

3.1 碳點的光譜表征

如圖1可見，該碳量子點在紫外光區300～500 nm有很強的吸收，在此波段內隨波長的增加而吸收強度逐漸減弱。

圖2可觀察到該方法制得的碳點具有很高的熒光性，且最高熒光強度已經超越了儀器的量程，因此可以適當稀釋碳點濃度，以方便試驗的進行。

圖3為不同激發波長下碳點的熒光發射峰。由圖可見，碳點在不同的激發波長下均有熒光發射峰。隨著激發波長的增大，熒光強度先增大后減小，熒光峰位置不變，說明該方法合成的熒光碳點的熒光峰的位置不受激發波長影響。以380 nm為激發所得出的熒光峰值最高，確定后續試驗選擇380 nm為碳點的最佳激發波長。

3.2 四環素對碳點的熒光猝滅作用

圖4為380 nm激發波長下，碳點溶液（a）以及添加四環素的碳點溶液（b）的熒光發射光譜圖。從圖中很明顯看出，加入四環素的碳點溶液熒光峰有很明顯的下降，說明四環素對碳點有明顯的猝滅作用。

圖1 碳點的紫外吸收光譜

圖2 碳點的熒光發射光譜

3.3 四環素猝滅碳點熒光的反應機理的探討

本試驗探討了四環素濃度對碳點猝滅的規律性。圖5為在pH值為7.4的PBS中，加入一定量的碳點溶液，再分別加入不同濃度的四環素，以得到碳點的熒光發射光譜變化圖。

圖3 不同激發波長下碳點的熒光值變化趨勢

圖4 380 nm激發波長下，碳點溶液（a）以及添加四環素的碳點溶液（b）的熒光發射光譜圖。

從圖5可知，隨著四環素的濃度不斷增加，碳點的熒光強度逐漸下降，但是其熒光峰值的波長仍然在435 nm左右。結果說明，加入四環素后體系發生變化，導致碳點的熒光猝滅。分析原因可能是由于四環素可以和熒光碳點表面的羥基和羧基發生絡合反應[11]，從而產生非特異性相互作用，對碳點的熒光產生猝滅所致[12]。而且這種下降的梯度具有規律性，線性關系趨勢很明顯，由此可以構建一種以熒光碳點的猝滅機理來檢測四環素含量的方法。

3.4 檢測條件的優化

3.4.1 體系中pH值的優化

針對四環素對碳點猝滅的反應pH值進行優化，發現反應pH值在7.4時，四環素對碳點的猝滅已經達到最大，再繼續反應，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩定，故本試驗將反應pH值確定為7.4（圖6）。

3.4.2 反應時間對體系熒光改變量?F的影響

針對四環素對碳點猝滅的反應時間進行優化，結果發現反應時間在5 min時，四環素對碳點的猝滅已經達到最大，再繼續反應，效果稍有不佳，猝滅也趨于穩定，故在本試驗后的反應時間確定為5 min（圖7）。

3.4.3 反應溫度對體系熒光改變量?F的影響

針對四環素對碳點猝滅的反應溫度進行優化，結果發現反應溫度在25℃時，四環素對碳點的猝滅已經達到最大，其它溫度下也有改變，但均小于此溫度下的熒光變化量，故在本試驗的反應溫度確定為25℃（圖8）。

3.5標準曲線和檢出限

在上述各種優化條件下進行檢測，考察碳點在檢測四環素的線性范圍以及最低檢出限，并根據試驗結果繪制了標準曲線，結果如圖9所示。試驗結果表明，當四環素濃度在1.0×10-2～1.0×10-7mol/L范圍增加時，檢測體系的整體熒光強度隨之呈規律性的下降趨勢。以四環素濃度以10為底的對數值為 X，以碳點的熒光變化量ΔF為Y，建立線性回歸方程Y=106.09X+835.51，線性相關系數為0.9728。以不添加四環素的碳點體系溶液作為空白溶液，平行測定10 次，以3倍信號強度的標準偏差除以轉換后的標準曲線斜率，最終得到的檢出限為4.3×10-7mol/L。

圖5 不同濃度的四環素對碳點的熒光猝滅作用

圖6 pH值對體系熒光猝滅的影響

圖7反應時間對碳點的熒光猝滅的影響

3.6 實際樣品中四環素含量的測量

本試驗以伊利純牛奶樣品作為研究測定對象，經過脫脂、稀釋等前處理后得到10-1和10-22個稀釋度，在稀釋的體系中加標樣品檢測其熒光猝滅，帶入標準曲線計算出標準方差、回收率。結果得出表1，其標準差分別為0.0125和0.035，回收率為123%和120%，回收率較高原因可能是所檢測樣品中本來就含有微量的四環素。

4 討論

乳制品中四環素類藥品殘留的快速檢測方法有很多種，本試驗建立的熒光分析方法具有較高的靈敏度和選擇性，且合成碳點的方法簡單、方便、快捷，熒光性良好且穩定。在進行正式試驗前，通過大量預試驗的比較分析，得出時間、pH值、溫度這3 個因素對熒光猝滅的影響比較大。因此，本試驗選定這3 個因素，分別進行優化試驗，然后在優化條件下得出良好的線性方程Y=106.09X+835.51，較高的相關系數 0.9728，較寬的檢測線性范圍級檢出限4.3×10-7mol/L，測定不同濃度的四環素對碳點熒光猝滅的影響。本試驗檢測牛奶樣品測得的回收率超過100%，可能是所測樣品本身含有微量的四環素存在。本方法實現其定性檢測的高效性和定量檢測的準確性，寄希望在深入開展乳制品中四環素類獸藥殘留檢測技術中提供一條新的技術路線

表1 實際樣品的檢測

圖8 反應溫度對碳點的熒光猝滅的影響

圖9 熒光強度變化量與四環素濃度之間的線性關系