富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中總磷脂的含量測定方法研究

文/胡淑紅 王榮艷

（杭州立高檢驗檢測技術(shù)研究院有限公司）

乳脂肪球膜（MFGM）含有豐富的磷脂。磷脂，是含有磷脂根的類脂化合物，是生命基礎(chǔ)物質(zhì)，屬于復(fù)合脂，也稱磷脂類、磷脂質(zhì)，為兩性分子，一端為親水的含氮或磷的頭，另一端為疏水（親油）的長烴基鏈。磷脂對活化細(xì)胞，維持新陳代謝，基礎(chǔ)代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強人體的免疫力和再生力，都能發(fā)揮重大的作用。 另外，磷脂還具有促進脂肪代謝，防止脂肪肝，降低血清膽固醇、改善血液循環(huán)、預(yù)防心血管疾病的作用。不僅如此，磷脂還對嬰幼兒神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育有積極作用，能提高嬰幼兒的認(rèn)知和發(fā)展，并降低很多感染的風(fēng)險。因此富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉的磷脂含量測定顯得十分重要。

目前尚未有對乳及乳制品中總磷脂測定的方法，其他基質(zhì)中磷脂含量的測定主要有重量法、紫外分光光度法（UV法），傅立葉紅外光譜法（FTIR法）等[1]。

本試驗采用鉬藍(lán)法對富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉中的總磷脂（簡稱“試樣”）含量進行測定，并對其方法的穩(wěn)定性、精密度和準(zhǔn)確度進行研究。

1 儀器和設(shè)備

分光光度計（配1 cm比色皿）、離心機（5 000 r/min）、超聲波清洗器、分析天平（感量0.1 mg）、馬弗爐（溫度可控制在550～600 ℃）、封閉式電爐（可調(diào)溫）、瓷坩堝（50 mL）、G3玻璃砂芯坩堝。

2 試劑和材料

本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的三級水。

2.1 磷酸二氫鉀：使用前在（105±2） ℃下干燥2 h。

2.2 三氯甲烷-甲醇溶液（體積比2:1）：將2 倍體積的三氯甲烷和1倍體積的甲醇溶液混合。

2.3 2.5%鉬酸鈉稀硫酸溶液：量取1 4 0 m L濃硫酸注入3 0 0 m L水中，冷卻至室溫，加入12.5 g鉬酸鈉，溶解并加水稀釋至500 mL，搖勻，靜置24 h備用。

2.4 0.015%硫酸聯(lián)氨溶液：將0.15 g硫酸聯(lián)氨溶解并定容至1 L。

2.5 50%氫氧化鈉溶液：將50 g氫氧化鈉溶解在50 mL水中。

2.6 鹽酸溶液（體積比1:1）：將鹽酸溶解與等體積水中。

2.7 抗壞血酸鈉溶液（25 g/L）：稱取2.5 g抗壞血酸鈉溶解并稀釋至100 mL，該溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.8 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取干燥的磷酸二氫鉀0.2197 g，用水溶解并稀釋定容至1 L，此溶液含磷0.05 mg/mL。

3 試驗方法

3.1 樣品提取

稱取試樣1.5 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加30 mL三氯甲烷-甲醇溶液，渦旋混合均勻，超聲30 min，于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，經(jīng)G3砂芯坩堝過濾，用10 mL三氯甲烷-甲醇溶液分兩次沖洗砂芯坩堝，濾液合并于坩堝中，將坩堝置于60～80 ℃水浴中蒸干，得到的提取物用于后續(xù)的分析測定。

3.2 試液制備

在3.1中得到的提取物中加入氧化鋅0.5 g，先在電爐上加熱至近干，逐漸加熱至全部炭化，將坩堝置于550～600 ℃馬弗爐中灼燒至完全灰化，約2 h。取出坩堝冷卻至室溫，加入10 mL鹽酸溶液溶解灰分并加熱至微沸，5 min后停止加熱，待溶解液溫度降至室溫，將溶解液過濾至100 mL容量瓶中，每次用大約5 mL熱水沖洗坩堝和過濾器3～4次，將濾液冷卻至室溫后，用氫氧化鉀溶液中和至出現(xiàn)渾濁，緩慢滴加鹽酸溶液至氧化鋅沉淀全部溶解，再滴加2 滴鹽酸溶液，最后用水稀釋定容至刻度，混勻待測。

3.3 空白試驗

除不加樣品提取物外其余都按3.1和3.2操作。

3.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6 支50 mL比色管，按順序加入標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，再依次加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL水，再在6 支比色管中加入硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，鉬酸鈉溶液2 mL，抗壞血酸鈉溶液2 mL，加塞，振搖3～4 次，去塞，沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10 min，移取溶液至潔凈干燥比色皿中，在650 nm處以試劑空白調(diào)節(jié)零點分別測定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，含磷量（0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.5 比色

移取待測液4 mL于50 mL比色管中，加水6 mL，加入硫酸聯(lián)氨溶液8 mL，鉬酸鈉溶液2 mL，抗壞血酸鈉溶液2 mL，加塞，振搖3～4 次，去塞，沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，充分搖勻，靜置10 min，移取溶液至潔凈干燥比色皿中，在650 nm處以試樣空白調(diào)節(jié)零點測定吸光值。

3.6 計算

試樣溶液中各組分含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得，試樣中總磷脂的含量計算公式如下：

式中：

X——樣品中總磷脂含量，單位為mg/g；

c——標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的被測物的含磷量，單位為mg；

m——試樣的質(zhì)量，單位為g；

V1——樣品灰化后的定容體積，單位為mL；

V2——比色時所取的待測液體積，單位為mL；

26.31——每毫克磷相當(dāng)于總磷脂的毫克數(shù)。

當(dāng)被測液的吸光度大于0.8時，需適當(dāng)減少吸取被測液的體積以保證吸光度在0.8以下。

4 結(jié)果與討論

4.1 線性考察

如表1和圖1所示。

4.2 方法精密度試驗

4.2.1 日內(nèi)精密度

對1 份試樣檢測試驗，做6 個平行試驗，測試結(jié)果如表2所示。

4.2.2 日間精密度

對1 份試樣試驗，每天做4 個平行試驗，做3 天試驗，測試結(jié)果如表3所示。

4.3 方法準(zhǔn)確度試驗

同一試樣作為本底，本底含量為62.96 mg/g，分別進行3 組不同濃度的加標(biāo)試驗，每組做3 個平行試驗，計算加標(biāo)回收率，如表4所示。

表1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線測試數(shù)據(jù)

表2方法日內(nèi)精密度測試數(shù)據(jù)

表3方法日間精密度測試數(shù)據(jù)

表4磷脂試樣加標(biāo)測試數(shù)據(jù)

4.4 方法穩(wěn)定性試驗

分別精密量取0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL濃度為0.05 mg/mL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 m L比色管中，依次加入1 0.0 mL、9.0 mL、8.0 mL、7.0 mL純水，其余步驟同3.4操作顯色，分別于0 h、1 h、2 h、3 h、4 h在650 nm處以試劑空白調(diào)節(jié)零點測定吸光值。如表5所示。

4.5 樣品的測定

分別對3 個批次富含乳球膜蛋白乳清粉進行總磷脂的含量測定，結(jié)果如表6所示。

4.6 討論

從圖1看出，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距值較小，R2=0.999，標(biāo)曲的線性良好，而且是隨著磷標(biāo)準(zhǔn)液的濃度增大，鉬藍(lán)吸光度值也增大。由此可得該試驗方法的鉬藍(lán)吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)液濃度成正比。由表2，表3可得，RSD值均在3%以下，本試驗方法的日內(nèi)精密度和日間精密度均為良好。由表4可得，通過不同的加標(biāo)量所得的回收率均在8 0%～1 0 5%的范圍內(nèi)，回收率的平均值均在90%以上，而且R S D值均在3%以下，試驗值均比較穩(wěn)定。由表5得，該方法鉬藍(lán)顯色在4h內(nèi)穩(wěn)定。由表2，表3的精密度，表4的準(zhǔn)確度和表5的穩(wěn)定性可得，總磷脂提取較為完全，而且穩(wěn)定，試驗誤差小，準(zhǔn)確率高。由表6可得，不同批次的富含乳球膜蛋白乳清粉的總磷脂測定含量RSD均在3%以下，故試驗測定值比較穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性測試數(shù)據(jù)

表6 富含乳球膜蛋白乳清粉中總磷脂的含量

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

試驗結(jié)果表明，本研究建立的方法所需設(shè)備簡單，方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為以富含乳脂肪球膜蛋白乳清粉為原料的乳制品中總磷脂的測定提供依據(jù)。