CHO細胞生產蛋白糖基化影響的研究

摘 要： 蛋白質的糖基化對于其作為生物治療劑至關重要，已經展開了許多對中國倉鼠卵巢細胞生產蛋白糖基化的研究。生物過程參數和培養基添加劑可調節蛋白質的糖基化。本文介紹了工程策略方面的進展。

關鍵詞： CHO細胞;糖基化;蛋白

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞被廣泛用于生物治療藥物的生產中，部分原因是它們能夠產生糖基化的蛋白質。糖基化通過影響分子的半衰期和效率而在蛋白質功能中起關鍵作用，并有可能對糖蛋白的安全性產生不利影響[1]。研究人員采用不同的方法包括改變工藝條件、補充培養基添加劑以及宿主細胞系的修飾來調節蛋白質分子的糖基化譜。

糖蛋白通常是指各種翻譯后修飾，尤其是蛋白質N-糖基化，它對蛋白質的功效和免疫原性起著至關重要的作用。蛋白質功能受糖基化作用，在結合、溶解度、穩定性和折疊等方面有影響。

1 通過工藝優化控制糖基化

通過優化工藝條件如溶解氧（DO）、pH、溫度和培養持續時間等從而影響蛋白質的糖基化。

Chotigeat及其同事發現，將重組人CHO的卵泡刺激素（hFSH）的表達受β肌動蛋白啟動子控制的重組CHO細胞系在無蛋白質培養基上穩定灌流培養。增加DO濃度提升了唾液酸轉移酶的活性，FSH亞型向較低的pI部位轉移，這使得唾液酸含量的增加。隨著hFSH比生產率的增加，其亞型分布向低pI亞型轉移[2]。

相反，對Epo-Fc融合蛋白[3]和rEPO[4]的研究發現DO對唾液酸化沒有影響。對表達EPO的CHOK1細胞的進一步研究表明，DO對觸角程度沒有影響，但是有一個最佳的DO范圍可使巖藻糖基化最大化。對于IgG1的末端半乳糖基化，隨著DO濃度的降低觀察到聚糖鏈半乳糖基化程度降低[5]。

CHO培養過程中向較低培養溫度的轉變也會影響糖基化。使用表達人組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）的CHO細胞進行的研究與多糖位點占有率的增加和溫度的降低相關[6]。對高度糖基化融合蛋白Epo-Fc的研究中確定降低培養溫度會降低產物唾液酸化。對表達人EPO的DUXB11細胞的類似研究發現，低于32°C的溫度會導致四唾液酸化的N-聚糖，酸性同工型和四觸角結構減少。

對于在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表達的兩種不同的重組糖蛋白，重組人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）和重組酶（糖蛋白2-GP2）。這兩個分子都包含一個可變占據的N-糖基化位點。Martin Gawlitzek等研究了影響這些分子位點占據的不同環境因素（占位點的程度）。向培養基中添加額外的錳或鐵會使完全占據的t-PA（I型t-PA）的比例增加約2.5-4%。將培養溫度從37℃降低到33℃或31℃，t-PA的位點占用率提高4%。對于重組酶（GP2），發現培養pH和丁酸鹽添加的時間可用于將N-聚糖位點占用控制在特定范圍內。培養液pH值的升高與位點占用率的降低相關。這些結果顯示了細胞培養條件和培養基成分影響哺乳動物細胞培養物中表達的重組糖蛋白的產品質量的重要性。

2 培養基成分補充

除了優化細胞培養條件外，補充培養基也是調節蛋白質糖基化的一個重要研究領域。CHO細胞產生的嵌合重鏈抗體（EG2）的糖基化模式受培養物中葡萄糖降解的影響，非糖基化mAb的比例隨著細胞暴露在葡萄糖耗盡的培養基中的時間而增加。

Jintao Liu發現有限的核苷酸糖前體和細胞外唾液酸酶不影響唾液酸含量的降低。寡糖分析表明缺乏蛋白質半乳糖基化是唾液酸含量降低的潛在原因;通過在2 L生物反應器中對半乳糖的補充，顯示總唾液酸含量增加了44%，在CHO-GS宿主中表達的Fc融合蛋白的唾液酸化多糖含量增加了20.3。在最近的研究中，錳被證明在葡萄糖限制的培養基中添加時可以增加M5高甘露糖聚糖。

3 展望

新型基因組編輯工具的出現開辟了細胞系工程領域，并為工程化CHO細胞產生的治療藥物的糖基化提供了許多選擇。隨著用于評估聚糖譜的分析方法的不斷改進，準確地分離具有高比生產率和所需糖型的克隆的能力將得到改善，優化細胞系發育從而生成具有目標糖基化譜的克隆。

參考文獻：

[1]Rudd P M，Elliott T，Cresswell P，et al.Glycosylation and the Immune System[J].Science，2001，291（5512）：2370-2376.

[2]Chotigeat W，Watanapokasin Y，Mahler S，et al.Role of environmental conditions on the expression levels，glycoform pattern and levels of sialyltransferase for hFSH produced by recombinant CHO cells[J].Cytotechnology，1994，15（1）：217-221.

[3]Trummer E，Fauland K，Seidinger S，et al.Process parameter shifting：Part II.Biphasic cultivation—A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（6）：1045-1052.

[4]Restelli V，Wang M D，Huzel N，et al.The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells[J].Biotechnology and bioengineering，2006，94（3）：481-494.

[5]Kunkel J P，Jan D C H，Jamieson J C，et al.Dissolved oxygen concentration in serum-free continuous culture affects N-linked glycosylation of a monoclonal antibody[J].Journal of Biotechnology，1998，62（1）：55-71.

[6]Gawlitzek M，Estacio M，Tobias Fürch，et al.Identification of cell culture conditions to control N‐glycosylation site‐occupancy of recombinant glycoproteins expressed in CHO cells[J].Biotechnology & Bioengineering，2009，103（6）.

作者簡介： 杜秀冬，男，漢族，河北宣化人，本科，工程師，研究方向：醫療工程。