PPARγ激動(dòng)劑對(duì)COPD大鼠炎癥及血管重塑指標(biāo)的影響

王 琛， 李 智， 譚 林

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，青島 266071

根據(jù)最新的《全球疾病負(fù)擔(dān)》報(bào)告，目前所有非傳染性慢性肺部疾病加在一起構(gòu)成全球非傳染性疾病的第3大死因，其中2016年慢性阻塞性肺疾病(COPD)造成230萬(wàn)人死亡[1]。在COPD中，肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension, PH)的患病率與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，多達(dá)90%的患者靜息平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)超過(guò)20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。約有1%的COPD患者患有嚴(yán)重的PH，mPAP值在35～40 mmHg，PH在COPD中的存在和嚴(yán)重程度對(duì)患者生存率有重要影響。缺氧引發(fā)的肺血管收縮是PH的主要致病機(jī)制，持續(xù)的血管收縮導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)的變化，主要影響肺小動(dòng)脈。在COPD中，炎癥、低氧、煙草煙霧的暴露導(dǎo)致血管重塑、肺血流動(dòng)力學(xué)改變[2]。

過(guò)氧化物酶增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)的激動(dòng)劑羅格列酮在COPD患者中給藥時(shí)可抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子、趨化因子和活性氧類(reactive oxygen species,ROS)等的產(chǎn)生，且羅格列酮可劑量依賴性地抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)產(chǎn)生，PPARγ參與COPD的氣道炎癥過(guò)程[3]，但針對(duì)其在COPD患者炎癥因子白介素-8(IL-8)的產(chǎn)生和肺動(dòng)脈的血管重塑的作用研究尚少。肺小動(dòng)脈血管的重塑是導(dǎo)致PH的主要原因，目前COPD合并PH患者的治療仍以針對(duì)誘因治療為主，臨床治療效果不佳，個(gè)體化差異較大。為此，本研究擬探討鹽酸羅格列酮調(diào)控PPARγ轉(zhuǎn)錄水平對(duì)COPD大鼠炎癥因子的產(chǎn)生和肺小動(dòng)脈血管重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 雄性Wistar大鼠36只，購(gòu)自青島市藥物檢驗(yàn)檢疫所，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，SPF級(jí)飼養(yǎng)。試劑：哈德門(山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，中國(guó))；鹽酸羅格列酮(文迪雅，4 mg/片)；LPS(美國(guó)Sigma公司)；大鼠白介素-8(IL-8) ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))；TRIzol試劑、M-MuLV一步法RT-PCR試劑盒、引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。主要儀器：自制煙熏箱和低氧倉(cāng)。低氧倉(cāng)大小約54 cm×30 cm×32 cm，鉆5個(gè)直徑3 cm孔，使倉(cāng)內(nèi)保持常壓，并往倉(cāng)內(nèi)注入氮?dú)庹{(diào)節(jié)氧濃度，使氧體積分?jǐn)?shù)維持在0.1左右。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將大鼠按數(shù)字法隨機(jī)分為藥物治療組(A組)、非藥物治療組(B組)和空白對(duì)照組(C組)，每組12只。A組參照鐘小寧等[4]方法制作COPD肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，B組與A組相似，但第3周開始每只大鼠每天給予鹽酸羅格列酮1 mg治療；C組給予相同體積生理鹽水模擬造模，正常飼養(yǎng)。

1.3 組織學(xué)檢查 以100 g/L水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，打開胸腔，取雙肺分別置于-70℃冰箱和40 g/L中性甲醛中保存?zhèn)溆谩７谓M織以40 g/L中性甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。每只大鼠肺組織切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，按照文獻(xiàn)[5]的方法觀測(cè)直徑50～100 μm的腺泡內(nèi)肌化型小動(dòng)脈的血管壁面積、血管總面積，并計(jì)算血管壁面積/血管總面積(MA%)比值。

1.4 IL-8檢測(cè) 準(zhǔn)備好標(biāo)準(zhǔn)品并用洗滌緩沖液1∶1稀釋于反應(yīng)孔內(nèi)，后取大鼠肺組織50 mg，加入適量生理鹽水搗碎，離心10 min后取待測(cè)樣品上清液50 μL置于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50 μL生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h，甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，震蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作3次后，每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min；甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復(fù)此操作3次后，每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min，避免光照，取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后立即在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度(D)值，以D值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制相應(yīng)曲線，并根據(jù)其D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)濃度。

1.5 RT-PCR檢測(cè)PPAR mRNA的轉(zhuǎn)錄水平 取肺組織50 mg，加入0.5 mL TRIzol提取總RNA，測(cè)定RNA濃度。取1 μL mRNA產(chǎn)物按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以此為模板行PCR擴(kuò)增。引物通過(guò)Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。PPAR上游引物序列為5′-T CTCT CCGTAAT GGAAGACC-3′，下游引物序列為5′-GCAT TAT GA GACAT CCCCAC-3′；actin上游引物序列為5′-AGCCAT GTAGCCA TCC-3′，下游引物序列為5′-AGCCAT GTAGCCA TCC-3′。將PT-PCR產(chǎn)物在12 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳(100 V)30 min，在紫外燈下檢測(cè)目的條帶電泳情況，應(yīng)用Scion image軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行吸光度掃描，以面積吸光度表示條帶的豐度，以此作為mRNA表達(dá)的強(qiáng)度，以actin作為內(nèi)參照，PPARγ mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用PPARγ/actin計(jì)算得出。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。組間死亡率比較采用Fisher確切概率法，PPARγ轉(zhuǎn)錄水平、MA%與IL-8值多組間比較采用單因素方差分析LSD法，組間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 存活率分析 A組有2只大鼠分別在第5、6周死亡；B組、C組大鼠無(wú)死亡。因樣本量<40，所以采用Fisher確切概率法進(jìn)行計(jì)算。A組大鼠存活率低于C組，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher值=3.856,P=0.167)。

2.2 血管壁病理改變 病理切片結(jié)果(圖1)示：A組大鼠血管壁周圍中性粒細(xì)胞增多，即淋巴細(xì)胞形成，管壁平滑肌層增厚，其外觀可見大量膠原沉積。C組大鼠血管壁周圍無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁平滑肌層未見增厚，無(wú)膠原沉積。B組血管壁重塑及炎性浸潤(rùn)情況較A組減輕，但仍較C組嚴(yán)重。病理切片由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師雙盲讀片。光鏡下病理評(píng)分基于以下變量：肺小動(dòng)脈周圍中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、血管平滑肌層增厚程度。嚴(yán)重程度評(píng)分：無(wú)損傷=1分(無(wú)病理改變)；輕度損傷=2分(有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且血管壁輕度增厚)；重度損傷=3分(大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)且血管壁明顯增厚)。每個(gè)樣本有5個(gè)切片，被隨機(jī)分析，以平均值作為樣本的最終評(píng)分。結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理切片評(píng)分

2.3 肺小動(dòng)脈血管重塑比較 對(duì)直徑50～100 μm肌化性動(dòng)脈進(jìn)行分析，結(jié)果(表1)顯示：A組、B組、C組間MA%差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.84,P<0.01)，A組MA%較C組明顯升高，B組MA%較A組明顯下降(P均<0.05)。

2.4 IL-8檢測(cè)指標(biāo)比較 結(jié)果(表1)表明：A組、B組、C組之間IL-8差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.87,P<0.01)，A組明顯高于B組，B組高于C組(P均<0.05)。

表1 A、B、C組MA%和IL-8比較

2.5 肺組織PPARγ轉(zhuǎn)錄水平比較 結(jié)果(圖2)表明：A、B、C組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.39,P<0.01)，C組、B組、A組PPARγ/actin指標(biāo)逐漸下降，A組明顯高于B組，B組高于C組(P均<0.05)。

圖2 3組PPARγ/actin水平比較

2.6 PPARγ轉(zhuǎn)錄水平與MA%、IL-8值的相關(guān)性 B組大鼠中PPARγ轉(zhuǎn)錄水平與MA%負(fù)相關(guān)(r=-0.662,P<0.05)，與IL-8值負(fù)相關(guān)(r=-0.615,P<0.05)，而B組中MA%與IL-8正相關(guān)(r=0.980,P<0.05)。

3 討 論

COPD是感染引起的、進(jìn)行性氣道炎癥，慢性氣道炎癥在COPD中起主要作用，可引起杯狀細(xì)胞增加、黏液腺增生、肉芽腫和肺氣腫，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活并釋放TNF-α、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化肽-1(MCP-1)、白三烯B-4和ROS等炎癥介質(zhì)和趨化因子。目前氣道上皮細(xì)胞已被證實(shí)可分泌IL-8，引起小氣道纖維化進(jìn)展，是COPD的炎性標(biāo)志物。另有國(guó)外研究[6]表明，IL-8是使中性粒細(xì)胞聚集的主要細(xì)胞因子，其也被認(rèn)為是COPD發(fā)展的關(guān)鍵因素。香煙煙霧足以刺激COPD氣道中IL-8的過(guò)度釋放，且在COPD急性加重期時(shí)，中性粒細(xì)胞和循環(huán)中的IL-8可在氣道中大量聚集。

在COPD慢性炎癥的損傷與修復(fù)過(guò)程中，肺小動(dòng)脈血管平滑肌的增殖和血管壁周圍大量的膠原沉積共同參與了肺血管壁結(jié)構(gòu)的重建[7-8]。目前作為PPARγ激動(dòng)劑的噻唑烷二酮(TZD)，其與糖皮質(zhì)激素受體相似，是具有抗氧化作用的核激素受體超家族成員之一，通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮有效的抗氧化和抗炎作用，包括下調(diào)NF-κB和其他促炎轉(zhuǎn)錄因子[3]，雖然其主要作為新型胰島素增敏劑，被廣泛用于2型糖尿病的治療，但也在多種肺細(xì)胞類型中普遍表達(dá)，包括肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)性肺高壓動(dòng)物模型(主要通過(guò)低氧誘導(dǎo)肺高壓)中，肺和肺小動(dòng)脈中的PPARγ表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致發(fā)展為PH，這提示PPARγ在PH中具有保護(hù)作用。PPARγ激動(dòng)劑TZD藥物羅格列酮激活PPARγ是對(duì)抗PH的有前途治療劑，可以保護(hù)肺小動(dòng)脈，部分原因是可以通過(guò)抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移而實(shí)現(xiàn)該作用[9]。

本研究主要探討PPARγ激動(dòng)劑是否在低氧、煙熏、LPS誘導(dǎo)下的COPD大鼠肺組織中有抑制促炎因子IL-8的生成和改善血管重塑的作用。病理切片顯示，B組肺血管壁重塑及其周圍的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較A組減輕，但仍較C組嚴(yán)重；相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組、B組大鼠的MA%比值、IL-8均高于C組，A組大鼠明顯高于B組。A、B、C組肺組織內(nèi)PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平依次遞增，B組大鼠PPARγ轉(zhuǎn)錄水平與MA%比值、IL-8均負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可以抑制肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖、抑制血管結(jié)構(gòu)重塑、抑制促炎因子IL-8生成，抑制IL-8的生成可能抑制了肺血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，而肺部炎癥是COPD進(jìn)展的核心機(jī)制[10]，那么本研究表明，羅格列酮可能是通過(guò)抑制其血管周圍的炎癥、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而抑制血管壁的重塑和膠原蛋白的沉積，但是其中的具體生物學(xué)機(jī)制如何尚不清楚，這為進(jìn)一步的研究提供了方向。

綜上所述，羅格列酮在COPD大鼠中可通過(guò)激活PPARγ而有效抑制IL-8的生成，從而抑制肺血管壁平滑肌細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的沉積，這為羅格列酮治療COPD肺高壓提供了一定的理論支持，為臨床探索治療肺高壓的新型藥物提供了新思路。