Radil在肝癌組織中的表達(dá)及對肝癌發(fā)展的影響

孫海香， 史穎弘， 樊 嘉,， 楊柳曉*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科，上海 200032

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國肝癌發(fā)病率列惡性腫瘤第4位，死亡率占據(jù)第2位，對人類的健康造成嚴(yán)重威脅，因此深入探索分析肝癌的發(fā)病、發(fā)展機(jī)制對于肝癌治療具有非常重要的指導(dǎo)意義[1]。Radil(Ras association and DIL domains)是小G分子Rap的效應(yīng)分子，研究發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)起著重要的作用，但對其在肝癌組織中的表達(dá)及其意義研究較少。本研究旨在通過免疫組化及蛋白質(zhì)印跡(Western blot，WB)方法分析肝癌組織標(biāo)本中Radil的表達(dá)水平，通過過表達(dá)或敲低Radil表達(dá)水平分析其對肝癌細(xì)胞生長及運(yùn)動(dòng)的影響，探討其對肝癌發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 肝癌細(xì)胞Hep3B、Huh7購自中科院上海生化細(xì)胞所， MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所提供。所有肝癌細(xì)胞系均用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液于5% CO2，37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞生長至90%融合度用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。Radil過表達(dá)和敲低病毒購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 臨床標(biāo)本 選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝外科手術(shù)切除的肝癌標(biāo)本，癌旁標(biāo)本作為對照，并經(jīng)液氮速凍后立即置入-80℃冰箱中保存。組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，備染。

1.3 免疫組化 石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，微波修復(fù)抗原，漂洗后置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。5% H2O2室溫孵育30 min，血清封閉后加入Radil抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后加二抗室溫孵育，最后加入氧化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)常溫顯色，蒸餾水漂洗，逐級脫水，最后復(fù)染及封片，光鏡觀察。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，每T25培養(yǎng)瓶加入1 mL TRIzol試劑進(jìn)行裂解，氯仿乙醇法進(jìn)行抽提。所有RT-PCR反應(yīng)所需要的試劑均購自TaKaRa公司。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法 取對數(shù)生長期細(xì)胞約1×106個(gè)，PBS洗后加入放射免疫沉淀法緩沖液(RIPA)裂解液，冰上裂解30 min。利用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測562 nm波長的光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。按照說明書配制分離膠和濃縮膠，上樣量為80 μg。Radil、actin、 E-cadherin、fibronectin，抗體購自英國Abcam公司。

1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)組和對照組的對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整成3×104個(gè)/mL密度，96孔板每孔接種100 μL，接種后每隔24 h加入10 μL 細(xì)胞計(jì)數(shù)盒8(CCK8)檢測液，用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光值檢測。

1.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 用DMEM將實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞稀釋成1×106/mL單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室加入300 μL懸液，并在DMEM培養(yǎng)液加10%胎牛血清；72 h后經(jīng)4%多聚甲醛固定、Giemsa染液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 Radil在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Radil主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中，少量分布于細(xì)胞膜上(圖1A)。該蛋白在肝癌和癌旁組織中均有表達(dá)，其中肝癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織；WB結(jié)果也表明不同患者的Radil表達(dá)量不同，癌旁組織中的表達(dá)量顯著低于癌組織(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，Radil可能對肝癌的發(fā)展具有促進(jìn)作用。

圖1 Radil在肝癌組織中的表達(dá)

2.2 Radil 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 通過RT-PCR和WB檢測分析肝癌細(xì)胞系中Radil的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)移潛能的MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3細(xì)胞系中Radil的RNA和蛋白水平均顯著較高(圖2A、2B)。構(gòu)建高表達(dá)Radil載體，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，WB 驗(yàn)證得到高表達(dá)Radil的Huh7細(xì)胞系(圖2C)；轉(zhuǎn)染shRNA至LM3細(xì)胞中，篩選得到低表達(dá)水平的LM3細(xì)胞系(圖2D)。

2.3 Radil對肝癌細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Radil的Huh7細(xì)胞生長速度顯著高于對照組，而敲低Radil的表達(dá)則導(dǎo)致LM3細(xì)胞的生長速度顯著降低(圖3)。

2.4 Radil對肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響 對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)Radil導(dǎo)致Huh7細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力顯著增加(圖4A、4B)；降低Radil的表達(dá)顯著降低LM3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(圖4C、4D)。

2.5 Radil促進(jìn)肝癌發(fā)展可能的機(jī)制 進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)，Radil表達(dá)促進(jìn)fibronectin的表達(dá)，E-cadherin的表達(dá)量降低，凋亡分子Bax的表達(dá)量減少。Radil低表達(dá)的細(xì)胞則高表達(dá)E-cadherin和 Bax(圖5)。這些數(shù)據(jù)表明，Radil可能通過促進(jìn)細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)，降低細(xì)胞凋亡來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)肝癌的發(fā)展。

圖2 Radil 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖3 Radil對肝癌細(xì)胞增殖的影響

圖4 Radil對肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的影響

圖5 WB檢測EMT和凋亡分子的表達(dá)水平

3 討 論

肝癌是全球發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，雖然診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步使肝癌患者的生存率有了較大的提高，但是術(shù)后的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)比例仍居高不下，探索肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的機(jī)制對于肝癌的治療具有重要的理論和臨床意義[1]。

腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的過程，需要多個(gè)步驟：腫瘤細(xì)胞間的黏附連接被破壞，腫瘤與胞外基質(zhì)的黏附增加，金屬蛋白酶分泌增多，腫瘤細(xì)胞穿過基底膜進(jìn)入血管，之后隨著血液流動(dòng)進(jìn)入其他組織形成新的轉(zhuǎn)移灶?？梢姡[瘤細(xì)胞間連接和細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附連接對于腫瘤的轉(zhuǎn)移具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，Rap1通過結(jié)合下游效應(yīng)分子Radil影響整合素激活、聚集，進(jìn)而影響細(xì)胞延展、黏附和遷移過程，對腫瘤轉(zhuǎn)移有著重要的作用。敲低Radil可以有效降低乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，并阻斷乳腺癌的發(fā)展。過表達(dá)Radil可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)乳腺癌到肺臟的轉(zhuǎn)移[2]，本研究發(fā)現(xiàn)Radil在肝癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，增加肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，對肝癌發(fā)展具有促進(jìn)作用。

Rap1是小分子G蛋白R(shí)as家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其活化后構(gòu)象發(fā)生改變，與下游效應(yīng)分子結(jié)合將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中，參與激活多種信號通路，促進(jìn)黏附連接的形成，影響細(xì)胞的增殖、極性、運(yùn)動(dòng)等多種生物學(xué)功能。Radil是新發(fā)現(xiàn)的Rap1分子下游效應(yīng)分子之一，首次在神經(jīng)鞘前體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)時(shí)可以顯著降低細(xì)胞的黏附能力，是神經(jīng)鞘前體細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)的必需分子[3]。Radil可與Rap1、Gβγ亞基結(jié)合形成復(fù)合物，并使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞與基質(zhì)黏附處, 促進(jìn)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附連接。Radil過表達(dá)可以激活整合素，通過與胞外基質(zhì)的黏附影響中性粒細(xì)胞的趨化作用。并激活局部黏著斑激酶(FAK)信號通路，促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞對纖連蛋白的黏附。敲低Radil可以減弱fMLP受體對細(xì)胞黏附的影響[4]。Rap1有多個(gè)效應(yīng)分子，其他常見的效應(yīng)分子有以下3種。(1)B-Raf，可以與Rap1結(jié)合，并被激活，但其具體的生物學(xué)功能與細(xì)胞類型、生長條件有關(guān)；(2)Ra-1，其可以與Rap1結(jié)合，但不被激活，與Rap1的結(jié)合導(dǎo)致了其不能與Ras結(jié)合，從而阻斷了Ras信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；(3)AF-6，其與Rap1結(jié)合后促進(jìn)Rap1從核膜轉(zhuǎn)而定位到細(xì)胞膜，進(jìn)而通過整合素調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附作用。研究發(fā)現(xiàn)，這些效應(yīng)分子中只有Radil對細(xì)胞延伸有作用，但不同效應(yīng)分子間功能是否有交叉和不同，仍需要更多的研究。

綜上所述，Radil通過影響細(xì)胞延伸、黏附連接影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，通過對Radil水平的檢測，將有助于了解腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力。