MALDI-TOF MS直接靶板微滴生長法對耐碳青霉烯類腸桿菌的快速鑒別診斷價值

沈佳瑾， 黃聲雷， 周春妹， 胡必杰， 郭 瑋*

1. 復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫院感染病科，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫院醫院感染管理科，上海 200032

細菌耐藥已成為威脅全球公共衛生的一大難題，全國CHINET數據[1]顯示，2005—2018年耐碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)的比例持續上升，尤其是肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率上升幅度超過8倍，給臨床治療帶來極大挑戰。Idelevich等[2]在2018年首次采用基于MALDI Biotyper系統的基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)直接靶板微滴生長法(direct-on-target microdroplet growth assay，DOT-MGA)快速檢測美羅培南的耐藥性，該方法快速、通量大，近年來迅速發展。本研究首次使用VITEK MS系統，并對現有DOT-MGA方法做出改進，選擇的菌株為CRE中最常見且分離率最高的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，選擇亞胺培南、美羅培南和厄他培南3種臨床常用的碳青霉烯類藥物，評估DOT-MGA快速鑒別CRE的準確性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集復旦大學附屬中山醫院微生物實驗室2015—2019年非重復菌株，大腸埃希菌32株，其中耐碳青霉烯類大腸埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiacoli，CRECO)20株；肺炎克雷伯菌28株，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)16株。

1.2 儀器和試劑 VITEK MS質譜儀、VITEK MS-CHCA基質液(α-氰基-4-羥基-肉桂酸)及VITEK MS靶板購自法國生物梅里埃公司。Phoenix ID Broth及PhoenixSpec比濁儀購自美國BD公司。亞胺培南、美羅培南、厄他培南藥敏試劑及CAMHB肉湯(陽離子調節MH肉湯)購自溫州康泰生物科技有限公司。哥倫比亞血瓊脂平板購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司。

1.3 微量肉湯稀釋法 菌株接種哥倫比亞血瓊脂平板，(35±1)℃孵育18～24 h后備用。挑取新鮮純菌落于Phoenix ID Broth中，采用PhoenixSpec比濁儀調制0.5麥氏濁度菌懸液，并用CAMHB肉湯進行1∶200稀釋，使菌液終濃度為5×105CFU/mL。將稀釋后的菌液分別接種于亞胺培南、美羅培南和厄他培南藥敏試劑板條(3種藥物濃度范圍均為0.125～256 μg/mL)，(35±1)℃孵育16～20 h后按試劑說明書判讀3種藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)，結果解釋參照CLSI 2019年M100文件。用大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853(購自上海市臨床檢驗中心)作為質控菌株。

1.4 DOT-MGA 用新鮮純菌落配制0.5麥氏濁度菌懸液，與CAMHB肉湯1∶100稀釋，使菌液濃度為1×106CFU/mL。用CAMHB肉湯稀釋藥敏試劑板條中的抗菌藥物，靜置30 min使其充分溶解，調節藥物濃度至亞胺培南4 μg/mL、美羅培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL。將3 μL菌液和3 μL藥物溶液混合于VITEK MS靶板孔內作為檢測孔，形成終體積為6 μL的微滴，同時用3 μL菌液和3 μL不加抗菌藥物的CAMHB肉湯混合作為生長對照孔。檢測孔和生長對照孔的菌液終濃度為5×105CFU/mL，藥物終濃度為亞胺培南2 μg/mL、美羅培南2 μg/mL、厄他培南1 μg/mL。為防止微滴在孵育過程中揮發，需將靶板置于濕盒中，(35±1)℃分別孵育3 h、4 h、5 h和6 h。將生長對照孔的成功鑒定率作為生長對照有效率，簡稱有效率。通過DOT-MGA與微量肉湯稀釋法結果的比較，計算靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值4個指標，評估DOT-MGA 4個孵育時間的結果準確性。

1.5 VITEK MS質譜鑒定 取出孵育完成的靶板，用移液器每孔吸去5 μL液體，殘留液體用加熱板60℃烘干。按照VITEK MS質譜儀標準化操作流程，將大腸埃希菌ATCC 8739(由法國生物梅里埃公司提供)涂在靶板的校準點位，所有檢測孔加1 μL VITEK MS-CHCA基質液，干燥后上機獲取蛋白圖譜。比較該圖譜與數據庫(SARAMIS MS-RUO v4.15.0)已知圖譜，經軟件(SARAMIS Premium v2.9.3)分析得出最終鑒定結果。

1.6 結果判定標準 軟件評估鑒定可信度在75.0%～99.9%時，視為有效的鑒定結果；鑒定可信度<75.0%時，無鑒定結果。當生長對照孔成功鑒定到種水平，即鑒定結果與目標菌一致且鑒定可信度在75.0%～99.9%時，DOT-MGA結果判定為有效，反之無效。在結果有效的條件下，由于微滴中的3種碳青霉烯類藥物濃度為CLSI 2019年M100文件中規定的中介折點濃度，若檢測孔成功鑒定到種水平，說明細菌在該濃度的抗菌藥物環境中生長，視為耐藥；若檢測孔無鑒定結果，說明細菌在該濃度的抗菌藥物環境中不生長，視為不耐藥(敏感或中介)。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計學分析。采用連續校正χ2檢驗比較有效率。采用Kappa檢驗評價DOT-MGA與微量肉湯稀釋法結果的一致性。Kappa等于1認為兩者完全一致；1>Kappa≥0.75認為一致性較好；0.75>Kappa≥0.4認為一致性一般；Kappa<0.4認為一致性較差。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 菌株MIC值分布 結果(表1)顯示：微量肉湯稀釋法檢測所有菌株的亞胺培南、美羅培南和厄他培南的MIC值。

表1 實驗菌株3種碳青霉烯類藥物的MIC值分布

2.2 肺炎克雷伯菌DOT-MGA檢測結果 結果(表2)顯示：肺炎克雷伯菌孵育至4 h時，有效率為92.9%(26/28)，DOT-MGA檢測3種碳青霉烯類藥物的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值均為100.0%，而有效率在孵育5 h后也達到100.0%。由于4 h和5 h的有效率差異無統計學意義(P=0.471)，判斷4 h是DOT-MGA鑒別CRKP的最佳孵育時間。

表2 肺炎克雷伯菌DOT-MGA檢測結果 N=28

2.3 大腸埃希菌DOT-MGA檢測結果 結果(表3)顯示：大腸埃希菌孵育至5 h時，有效率達100.0%，DOT-MGA檢測3種碳青霉烯類藥物的特異度和陽性預測值均為100.0%，亞胺培南的靈敏度為85.0%(17/20)、陰性預測值為80.0%(12/15)；美羅培南的靈敏度為70.0%(14/20)、陰性預測值為66.7%(12/18)；厄他培南的靈敏度為95.0%(19/20)、陰性預測值為92.3%(12/13)。因其孵育至6 h的結果準確性無進一步提升，判斷5 h是用DOT-MGA鑒別CRECO的最佳孵育時間。

表3 大腸埃希菌DOT-MGA檢測結果 N=32

2.4 一致性分析 將2種腸桿菌科細菌在最佳孵育時間的DOT-MGA結果與微量肉湯稀釋法進行一致性分析結果：肺炎克雷伯菌3種碳青霉烯類藥物的DOT-MGA結果與微量肉湯稀釋法完全一致(Kappa=1)，大腸埃希菌則表現為亞胺培南和厄他培南的一致性較好，且厄他培南(Kappa=0.93)優于亞胺培南(Kappa=0.81)，美羅培南一致性一般(Kappa=0.64)。

3 討 論

CRE感染與高死亡率密切相關，特別是CRE血流感染，其死亡率是非CRE血流感染的2～3倍[3]。快速鑒別CRE有利于臨床早期正確選擇抗菌藥物，降低患者死亡率。傳統藥敏試驗需16～20 h，耗時長；PCR法快速檢測CRE只能識別特定、已知的碳青霉烯酶[4]，對非產碳青霉烯酶機制或未知碳青霉烯酶導致的耐藥則無法檢測，且該方法對實驗室和人員要求高，儀器價格昂貴；Carba NP試驗同樣只能檢測產碳青霉烯酶的CRE，且操作復雜，人為判讀結果可能會有誤差。采用MALDI-TOF MS快速鑒別CRE現有3種方法[5]：(1)檢測菌株與碳青霉烯類藥物作用一段時間后的水解產物；(2)直接檢測菌株的碳青霉烯酶質譜特征峰；(3)通過DOT-MGA評估菌株的MIC值，其中第1種和第3種方法可解決上述問題。

本研究選用DOT-MGA，參考Idelevich等[6]得出的最佳微滴體積6 μL，首次采用VITEK MS系統代替MALDI Biotyper系統，并對現有方法做出了改進。其文章中使用特殊材質的紙巾通過毛細管效應去除孵育后靶板上的微滴。由于該材料不易獲得，預實驗時選用普通紙巾替代，但發現其吸水性不佳且會引起相鄰孔位的污染。故本實驗采用移液器吸去等量液體再用加熱板烘干的方式，實驗前期嘗試了吸去4.5 μL、5 μL和5.5 μL 3種方案，最終發現吸去5 μL液體的效果最好。

本研究主要評估了DOT-MGA在4個孵育時間點鑒別CRECO和CRKP的結果準確性。大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌在孵育3 h時的有效率為40.6%～67.9%，且DOT-MGA結果的重復性和準確性較差，不推薦作為常規檢測方案。大腸埃希菌孵育5 h、肺炎克雷伯菌孵育4 h時DOT-MGA結果的準確性已達4個孵育時間的最高值，延長孵育至6 h，質譜的鑒定可信度雖略有提升，但最終結果并無變化。

本研究中的28株肺炎克雷伯菌在孵育4 h時，僅有2株黏液性菌株生長對照孔無鑒定結果，其余菌株的DOT-MGA結果與微量肉湯稀釋法完全吻合，說明采用DOT-MGA鑒別CRKP的準確性高。在大腸埃希菌用此方法檢測時，發現部分CRECO的假陰性，3種碳青霉烯類藥物中厄他培南的準確性最高。20株CRECO在孵育5 h時，有3株亞胺培南、6株美羅培南、1株厄他培南的DOT-MGA結果為不耐藥，但在延長孵育時間至18 h后全部耐藥，可能由于某些碳青霉烯酶水解碳青霉烯類藥物的速度較慢，且不同碳青霉烯類藥物的作用位點及抗菌活性也有差異[7]，短時間孵育的菌量尚達不到質譜檢測的閾值，需要延長孵育時間才能得到準確的檢測結果。本研究的菌株數量不多，且菌株的MIC值分布不均，實驗結果可能有一定局限性，未來需加大菌株量來進一步完善。

DOT-MGA具有快速、原理簡單、操作方便、實用性強等優點，運用相當廣泛，除了鑒別CRE之外，還可檢測其他菌株類型及其他抗菌藥物的耐藥性。有研究[8]使用該方法篩選耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，或通過加和不加酶抑制劑的DOT-MGA結果差異進行ESBLs及AmpC酶的檢測[9]。此外，報陽后的血培養標本通過過濾、洗滌、離心等前處理，將富集的病原菌直接進行DOT-MGA檢測，可在數小時內獲得特定藥物的耐藥性結果與菌株鑒定結果[10]。然而DOT-MGA作為一種新方法，其標準化和重復性有待考察，未來或許可以通過引入自動化系統或制造商品化藥物凍干粉包被的靶板來解決這一問題[11]。另外，DOT-MGA現仍處在研究的起步階段，仍需繼續擴大菌株類型、增加菌株數量、探索實驗方案，來驗證現有方法的可靠性和重現性，并繼續擴展其在快速藥敏檢測領域的運用。

綜上所述，采用MALDI-TOF MS的DOT-MGA法鑒別CRE，快速、準確、操作簡便，特別是檢測CRKP的準確性高，可為臨床早期的抗菌藥物靶向精準治療提供幫助。