高鹽飲食對鹽敏感性高血壓大鼠腎臟損傷的影響

任 潔 胡經文 郭統帥 何明俊 劉富強 牟建軍

目前，許多國家都有相當比例的高血壓患者攝入大量的食鹽，約50%的原發性高血壓患者對鹽敏感，并伴有進行性腎損傷[1]。鹽是高血壓的重要易患因素，而血壓的鹽敏感性是血壓相對于高鹽攝入所呈現的一種升高反應，與氧化應激和炎癥反應密切相關[2]。研究[3]發現，腎臟參與血壓的調節以及高血壓的發病機制。在動物模型中，可以獨立地監測遺傳因素和飲食因素(飲食中鹽的含量)的相互作用[4]，因此，以動物模型為研究對象，研究鹽敏感性高血壓的發生、發展機制具有一定的實際意義。目前，鹽敏感性高血壓和相關腎損傷的潛在機制尚不清楚，因此，為了研究鹽敏感性高血壓大鼠腎臟損傷的機制，本實驗檢測和分析了鹽敏感性高血壓大鼠的腎臟炎癥和受損傷程度及腎臟中白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的表達變化，以期為鹽敏感高血壓的機制研究提供理論支持和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理 選擇西安交通大學醫學院醫學實驗動物中心[動物合格證號：SYXK(陜)2015-002]20只6～8周齡的雄性大鼠(Dahl/SS和SS-13BN各10只)，所有大鼠進行12 h的明暗循環且自由飲水。按照大鼠品系，將20只實驗大鼠分為鹽敏感性高血壓大鼠模型組(Dahl/SS大鼠)與對照組(SS-13BN大鼠)，每組10只。從實驗第1天開始，兩組大鼠喂食鹽含量為8%的高鹽飼料(AIN93標準飼料，南通特洛菲飼料科技有限公司)，正常給予飲用水喂食4周后，用尾動脈測壓法進行血壓測定，當模型組大鼠血壓>140 mmHg，則表明鹽敏感性高血壓大鼠模型構建成功。此后，分別處死兩組大鼠，并分離獲取腎臟組織進行下一步實驗。

1.2 腎臟組織學與免疫組化分析 取兩組大鼠腎臟組織浸于4%多聚甲醛溶液中，常溫環境下固定24 h，經全自動脫水機固定、梯度脫水、透明、浸蠟等過程后，進行石蠟包埋，然后切片，在光學顯微鏡(OLYMPUS，BX53)下觀察。

檢查分離獲取的100個腎小球標本，分析腎小球的損傷分數，以評估腎小球的系膜擴張、硬化和毛細血管塌陷的程度。根據腎小球損傷的面積百分比，將腎小球病變的嚴重程度進行分級。然后將切片在3% H2O2的甲醇(aladdin，M116115-10L)和5%正常馬血清(yuanye Bio-Technology，MP20006-500 mL)中孵育，以使非特異性染色最小化。將切片在37℃下孵育1 h，并在4℃下與第一抗體(羊抗兔抗IL-6和羊抗兔抗IL-1β，NordicMUbio，GAGp(Fc)]一起孵育過夜處理。然后，將切片與第二抗體(IgG，Abcam，ab150117)在37℃下室溫孵育1 h，使用DAB試劑盒(中杉金橋，ZLI-9019)可視化信號。

1.3 ELISA檢測 收集兩組大鼠的腎臟組織，勻漿處理后，取上清液，按照ELISA試劑盒(Raybiotech，ELH-APOC1-1)說明書的方法檢測腎臟組織中的Nephrinuria和TNF-α含量水平，用酶標儀(HBS-1096C)在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，根據試劑盒提供的標準品定量，并計算樣品濃度。

1.4 RNA提取與RT-PCR反應 采用RNA提取試劑盒(Biotek，RP55011)提取兩組大鼠腎臟組織的總RNA，并使用Advantage RT-PCR試劑盒(Solarbio，RP1100-50T)合成cDNA。將獲得的cDNA進一步稀釋5倍，并在實時PCR反應中，使用Taq Man大鼠特異性引物用于擴增和檢測基因的表達。RT-PCR反應程序為95℃變性10 min，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。引物序列如下：IL-6，F：5’-ATTCTACGGGCAAATTTCAGC-3’，R：5’-GAAATTCGATACAAGAAAGG-3’；IL-1β，F：5’-TGTAGCTAGGAAGCACCA-3’，R：5’-TCGTTGTACATAAGGAAAG-3’，GAPDH，F：5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，R：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。GADPH作為內參，使用2-ΔΔCt方法分析數據。

1.5 蛋白免疫印跡分析 采用標準方法對收集的兩組大鼠腎臟組織進行勻漿處理，并進行Western免疫印跡分析。在裂解緩沖液(RIPA，Amresco，M329-10ML)中制備組織勻漿液(100 mg腎臟加入1 mL RIPA)。按照BCA蛋白質測定試劑盒(PYH，C503061-1250ASSAYS)的方法測定兩組大鼠腎臟組織勻漿液中IL-6和IL-1β蛋白的濃度(每孔20 μg)。使用等量的蛋白質樣品(20 μg)進行Western Blot免疫印跡，使用IL-6(1∶1 000)和IL-1β(1∶1 000)的特異性抗體進行孵育，然后與相應的二抗室溫孵育1 h。使用增強化學發光(ECL)試劑(Beyotime，P0018FS)進行顯影，用GAPDH蛋白(Proteintech，10494-1-AP)作為內參，計算蛋白質相對表達水平。

2 結果

2.1 兩組大鼠血壓與腎小球組織化學檢測 模型組大鼠的收縮壓為(183.82±3.87)mmHg，對照組為(129.03±3.94)mmHg，兩組大鼠收縮壓的差異有統計學意義(t=21.842,P=0.001)。模型組大鼠的舒張壓為(167.25±2.63)mmHg，對照組為(129.03±3.94)mmHg，兩組大鼠舒張壓的差異有統計學意義(t=22.863,P=0.001)。模型組大鼠腎小球損傷區域和程度高于對照組。見圖1。

圖1 兩組大鼠腎小球組織化學檢測(×200)

2.2 兩組大鼠腎臟中腎Nephrinuria含量與腎損傷評分比較 模型組大鼠腎臟組織中Nephrinuria含量及腎損傷程度評分均高于對照組，兩組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠腎臟中腎Nephrinuria含量與腎損傷評分比較

2.3 兩組大鼠腎臟中TNF-α的含量和腎臟組織炎癥反應比較 模型組大鼠腎臟組織中的TNF-α含量為(623.14±43.12) pg/mg，對照組為(193.12±10.11) pg/mg，兩組差異有統計學意義(t=35.889，P=0.001)。模型組大鼠腎臟組織炎癥反應程度高于對照組。見圖2。

圖2 兩組大鼠腎臟組織炎癥反應程度(×200)

2.4 兩組大鼠腎臟組織中IL-6和IL-1β基因表達情況比較 模型組大鼠腎臟組織中炎癥因子IL-6和IL-1β mRNA的相對表達量均高于對照組，兩組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠腎臟組織中IL-6和IL-1β mRNA相對表達情況比較

2.5 兩組大鼠腎臟組織中IL-6與IL-1β蛋白表達情況比較 模型組大鼠腎臟組織中炎癥因子IL-6蛋白相對表達量為(1.71±0.08)，對照組為(0.23±0.09)，兩組差異有統計學意義(t=43.538,P=0.001)；模型組大鼠腎臟組織中炎癥因子IL-1β蛋白相對表達量為(2.23±0.13)，對照組為(0.65±0.21)，兩組差異有統計學意義(t=35.354,P=0.001)。

3 討論

研究[5]發現，鹽敏感性高血壓與進行性腎損傷有關，能夠導致由炎癥反應、氧化應激和內質網應激相關因子升高引起的終末期腎病。因此，本研究采用Dahl鹽敏感性大鼠(Dahl/SS)建立了鹽誘導高血壓和腎損傷的大鼠模型，通過組織化學觀察和相關炎癥因子檢測發現，高鹽攝取會引起鹽敏感大鼠腎臟的損傷和炎癥反應。本研究結果可以為臨床鹽敏感性高血壓的深入研究和治療提供理論參考和實驗依據。

在鹽敏感性高血壓大鼠中，腎臟損傷通常表現為明顯的Nephrinuria含量增加和腎小球損傷。高鹽飲食會對腎小球造成嚴重的損傷，且會影響腎臟的正常功能。其中可能的機理是支配腎臟的交感神經，在腎功能中發揮了其生理作用，與它們對腎血流量、腎小球濾過率、腎素分泌以及鈉在體內的重吸收調節有關[6-7]。本研究結果發現，模型組大鼠的腎臟組織中Nephrinuria的含量高于對照組，表明鈉的攝入或排泄可能與尿多巴胺排泄存在直接關系。此外，鈉的攝入還可通過改變神經活動和/或神經遞質的儲存和釋放來影響周圍神經系統的功能[8-10]。

組織病理學觀察結果進一步表明，高鹽飲食對鹽敏感性大鼠的腎小管鑄型形成和纖維化有顯著的促進作用。本研究中，鹽敏感高血壓大鼠的腎損傷與炎癥和氧化應激密切相關。研究[11]發現，高血壓Dahl/SS大鼠血管超氧化物濃度升高，血漿H2O2濃度升高，氧化應激增強。在Dahl/SS大鼠中，腎損傷與氧化應激有關，主要表現為降低NO的生物利用度和增加腎臟中超氧化物的產生[12]。研究[13]表明，氧化應激在過量高鹽飲食攝入而引起的腎損傷的發生和發展中起重要作用。本研究結果顯示，模型組大鼠腎臟損傷程度加重，可能與炎癥和氧化應激相關，與上述研究結果一致。研究[1-15]表明，內質網應激是心血管疾病中潛在的炎癥介質。本研究結果顯示，鹽敏感性高血壓模型組大鼠炎癥相關因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白質表達水平均高于對照組，且腎臟組織炎癥反應高于對照組，對腎小球也造成了明顯的損傷。

綜上所述，高鹽食物飲食攝取會對鹽敏感大鼠的腎臟造成嚴重的生理性損傷，引起炎癥反應，進而影響大鼠腎小球等腎臟器官的正常功能。