眼子菜莖的組織培養及快速繁殖體系建立

宋 倫，洪開文，宋 澤，鄭 重，劉 晶，扶長杰

(1.安順職業技術學院，貴州 安順 561000； 2.黔中民族藥(苗藥)資源開發與產業化協同創新中心, 貴州 安順 561000； 3.貴州大學 農學院，貴州 貴陽 550000)

眼子菜(PotamogetondistinctusA. Bennett J. Bot.)是眼子菜科(Potamogetonaceae)眼子菜屬 (Potamogeton)多年生水生草本植物。廣布于我國南北大多數省區，生于池塘、水田和水溝等靜水中，水體多呈微酸性至中性，是一種常見的稻田雜草，有時甚至是惡性雜草[1]。眼子菜屬植物入藥最早記載于明初期，朱橚編撰的《救荒本草》一書中載有菹草(PotamogetoncrispusLinnaeus Sp. Pl.)，即水藻，生于池塘及水泊中，莖如麄線，長100～133 cm，葉形似柳葉而狹長，故名柳葉菹；其葉似篷子葉，根麄如釵股而色白，味微咸性微寒。明代蘭茂《滇南本草》中記載牙齒草，又名牙拾草。生于田中，味苦、澀，性寒。止赤白痢疾，大腸下血、婦人紅崩漏下，惡血。其中的牙齒草即為眼子菜。在《中藥大辭典》中記載眼子菜具有清熱利水、止血消腫、驅蛔的功效。主治痢疾、黃疸、淋病、帶下、血崩、痔血、蛔蟲病、瘡瘍紅腫等。

眼子菜屬成分、藥理等研究相對較少，WARFARIN等[2]利用二氯甲烷從光葉眼子菜(PotamogetonlucensLinnaeus)中萃取出一種已知的呋喃糖苷和2種新型糖苷及羥基化脂肪酸，其均對月牙藻具有抑制作用；對比另外幾類眼子菜屬植物的非極性萃取物發現，這類糖苷在眼子菜屬植物中普遍存在。易道生等[3]用馬來眼子菜(PotamogetonintortusifoliusJ. B. He, L. Y. Zhou & H. Q. Wang)提取馬來眼子菜多糖，證明馬來眼子菜多糖Ⅰ(PMPSⅠ)由D-果糖和D-木糖組成，而馬來眼子菜多糖Ⅱ(PMPSⅡ)由 D-葡萄糖、D-果糖和另一未知單糖成分組成。KURASHOV等[4]第一次對小眼子菜(PotamogetonpusillusLinnaeus)的揮發油進行GC-MS分析，共測出133種揮發油組分。眼子菜屬植物除含蛋白質、脂肪、氨基酸、纖維素等常見成分外，還含有豐富的類胡蘿卜素[5-6]。眼子菜(PotamogetondistinctusA. Bennett J. Bot.)具有相應的中藥藥理作用、抗癌活性、抗氧化活性、抑菌抗炎活性、細胞因子誘導活性和其他藥理作用[7]，且對污染河道氮、磷有凈化吸收作用，可以充分調動河道的底質肥力、加速氮磷循環、豐富水中營養鹽、提高水體生產力，對治理污染河道水體有重大意義[8-9]。在《陸磯詩疏》《毛晉詩疏廣要》《爾雅》《救荒本草》及《本草綱目》等古籍中均有關于眼子菜屬植物食用的記載。同時眼子菜屬植物主要營養成分與稻谷相一致，氨基酸與玉米相近，還含有一些生理活性成分和微量元素，可提高動物免疫力和肌肉品質，因其野生能力較強、資源豐富、容易采集，是家畜、家禽和草食性魚類喜食的青綠飼料[10-11]。

眼子菜具有一定的潛在藥用價值和水生態恢復、食用、飼用價值。在農業上，眼子菜的相關研究在于如何防治[12]。對于該資源的開發和利用研究較少。眼子菜以全草或休眠芽入藥，采集時莖易斷，入藥部位難以大量收集。目前，鮮見眼子菜組織培養(以下簡稱“組培”)的相關研究報道。為此，以眼子菜莖為試驗材料，研究不同濃度6-糠基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、無機鹽和糖對眼子菜莖段出芽數、葉片數、根狀莖節數、生根數的影響，以期為眼子菜快速繁殖體系的建立及其應用提供技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料：眼子菜，于2019年5月采集于安順市西秀區蔡官鎮稻田中，經檢索《中國植物志》等相關資料鑒定為眼子菜。模擬其生境栽培于安順職業技術學院應用醫藥系中藥學專業實訓地中。取長勢健壯植株的幼嫩莖段為外植體進行試驗。

試劑：MS培養基(Murashige和Skoog 1962，固體培養基)，貴陽誠承化工設備有限公司；6-糠基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)，上海易恩化學技術有限公司；無菌水，自制。

儀器：超凈工作臺，蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；YM30Z高壓蒸汽滅菌器，上海三申醫療器械有限公司；光照培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司。

1.2方法

1.2.1培養基和培養條件根據試驗目的不同添加不同濃度的植物生長調節劑。以MS為基礎培養基，附加蔗糖3%，瓊脂均為6 g/L，pH均調至5.8～6.0，1/2MS培養基為MS基礎培養基中大量元素減半，附加蔗糖1.5%，其他成分不變。配制的培養基使用高壓蒸汽鍋121℃滅菌30 min。使用純凈水高壓滅菌制得無菌水。無菌營養液為使用MS培養基配方而不添加植物調節劑、蔗糖和瓊脂配制，高壓滅菌而得。培養溫度(25±1)℃，光周期12 h/d，光強約為60 μmol/m2·s，培養周期根據培養階段不同而變化。

1.2.2外植體消毒處理取長勢健壯的眼子菜幼嫩莖段，在自來水下沖洗1 h，無菌紗布濾干。于超凈工作臺上用浸泡75%乙醇的棉花擦拭1次，去除多余葉片、葉苞和不定根，并用無菌手術刀將其切成小段(每段需有2個莖節)。將切成小段的眼子菜用無菌水沖洗2次，75%酒精充分浸泡40 s，再用0.1%升汞充分浸泡10 min，取出后用無菌水沖洗3次，置入裝有無菌水的玻璃杯中等待接種。

1.2.3不定芽的誘導及繼代培養將消毒好的外植體接種(平放于培養瓶中)到A(MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、B(MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、C(MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、D(MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L)培養基上進行不定芽誘導，每組10次重復，每瓶4個外植體。萌芽后開始記錄其出芽數，每2 d觀察記錄數據1次。16 d為1個培養周期，將誘導培養出來的芽進行繼代或增殖培養。

1.2.4增殖培養將誘導出的不定芽切割分離為單株，接種于增殖培養基E1(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、E2(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+無菌水)、E3(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+營養液)、F1(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、F2(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+無菌水)、F3(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+營養液)、G1(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、G2(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+無菌水)、G3(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+營養液)、H1(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、H2(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+無菌水)、H3(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+營養液)中進行增殖培養，每組10次重復，每瓶4個單株。接種后第3天開始記錄其新增出芽數、葉片數和根狀莖節數，每2 d觀察記錄數據1次。8 d為1個培養周期，達到生根壯苗要求的數量時進行下一步生根培養。

1.2.5生根培養與煉苗移栽將增殖培養的眼子菜植物取出，接種于生根培養基I1(MS+IBA 0.5 mg/L)、I2(MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水)、I3(MS+IBA 0.5 mg/L+營養液)、J1(MS+IBA 1 mg/L)、J2(MS+IBA 1 mg/L+無菌水)、J3(MS+IBA 1 mg/L+營養液)、K1(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)、K2(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水)、K3(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+營養液)、L1(1/2MS+IBA 1 mg/L)、L2(1/2MS+IBA 1 mg/L+無菌水)、L3(1/2MS+IBA 1 mg/L+營養液)中進行生根培養，每組10次重復，每瓶1株眼子菜組培苗。接種后第3天開始記錄其新增出芽數、新增葉片數、新增根狀莖節數和生根數，每2 d觀察記錄數據1次。6 d為1個培養周期，將生根后的眼子菜組培苗打開瓶蓋，在培養室放置2 d。將植株從培養基中取出，去除苗根部的培養基，種植于帶有泥土的水箱中，水深2 cm，土深10 cm。放置在溫室陰涼處，常規管理。10 d后統計移栽成活率及苗生長狀況。

1.2.6評定規則按照各個階段的不同制定不同的評分標準，對每組每個指標求平均值，然后賦予每個指標一定評分( 滿分為100分)權重。

2結果與分析

2.1不同濃度KT和NAA對眼子菜芽誘導的影響

從表1可知，當KT與NAA濃度分別為0.1 mg/L和0.05 mg/L時，眼子菜莖段的誘導出芽數最低，為2.7個，綜合評分為27分；當KT與NAA濃度分別為0.05 mg/L和0.1 mg/L時，眼子菜莖段的誘導出芽數最高，為13個，評分為100分。綜合分析，當KT/NAA濃度比為較低時，有利于眼子菜芽的誘導，當KT/NAA濃度比為較高時，對眼子菜芽的誘導有一定的抑制作用。

表1 不同濃度KT和NAA處理眼子菜的出芽誘導狀況

2.2不同處理對眼子菜增殖培養的影響

由于第8天后部分培養瓶中葉片數量較多，難以觀察記錄指標，故以第8天的記錄數據進行指標評分。從表2可知，E1處理的評分最高，為72.4分，出芽數、生長葉片數和根狀莖數均最大，分別為5.3個、9張和8.3節； H1處理的綜合評分最低，為21.4分，其出芽數、生長葉片數和根狀莖節分別為1.3個、2.5張和2.8節。綜合分析，當6-BA濃度為1 mg/L，NAA濃度為0.05 mg/L，不添加無菌水或無菌營養液時，有利于眼子菜的增殖培養；當6-BA濃度為1 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L，不添加無菌水或無菌營養液時，眼子菜的增殖培養效果差。

表2 不同處理眼子菜的增殖培養狀況

2.3不同處理對眼子菜生根培養的影響

從表3可知，K2處理的綜合評分最高，為76.2分，其出芽數、葉片數、根狀莖數和生根數分別為5.7個、15.0張、8.7條和13.7條。G1處理的綜合評分最低，為17.8分，其出芽數、葉片數、根狀莖數和生根數分別為0.8個、4.5張、1.8條和1.8節。綜合分析，當培養基中無機鹽、有機質等含量較少，IBA濃度較低，添加無菌水時，有利于眼子菜根的誘導培養；當培養基中無機鹽、有機質等含量較高，IBA濃度較高時，對根的誘導培養有一定的抑制作用。

2.4組培苗移栽的存活率

煉苗結束后將組培苗移栽于帶有泥土的水箱中，放置在溫室陰涼處，常規管理。10 d后統計移栽成活率為98%。

表3 不同處理眼子菜的生根培養狀況

3結論與討論

研究表明，眼子菜芽的最佳誘導培養基為MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L，該條件下的出芽數為10個，大部分形成不定芽，誘導能力很好；眼子菜的最佳增殖培養基為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L，其出芽數、葉片數和根狀莖數分別為5.3個，9張和8.3節；眼子菜的最佳生根培養基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水，其出芽數、葉片數、根狀莖數和生根數分別為5.7個，15.0張、8.7節和13.7根；眼子菜莖的組培苗在模擬水田環境中存活率高，為98%，無需其他處理。

眼子菜的組織培養材料存在不易消毒、操作等特點，在培養過程中對組培苗進行觀察記錄時受制約因素較多，很難準確地對植株生長狀況進行評定。試驗在參考前人研究其他植物組織培養的基礎上，對各培養階段的眼子菜指標給予評分，再進行分析，能較為客觀地反映各處理間的總體差異，得到的試驗結果更加客觀和具有說服力。

研究在參考同屬植物竹葉眼子菜的組織培養方法的基礎上，對生長調節劑濃度進行了調整，在增殖培養和生根培養時考慮到眼子菜的水生環境，特別制造了液態環境(添加無菌水或無菌營養液)。通過試驗初步探索出眼子菜莖的組織培養方案，構建了以眼子菜莖為外植體誘導分化成苗的快繁體系，為后續眼子菜同屬植物組織培養的研究提供一定的研究基礎和技術支撐。

眼子菜資源分布廣、蘊藏量大，對農業生產危害嚴重，但其藥理方面的研究報道相對較少。若在成分、藥理等研究跟進的情況下，對該資源進行開發利用，農業上將會找到另一種治理眼子菜的途徑。