糧食作物中主要真菌毒素及其檢測方法的研究進展

王 星， 楊新文*， 費 晨， 王 印

(1.安徽中儲糧糧油質監中心， 安徽 合肥 230000； 2.山東中儲糧糧油質監中心有限公司， 山東 濟南 250100)

糧食作物是人類賴以生存的基礎物質，容易受到真菌毒素的污染。真菌毒素是真菌在生長過程中形成的一類對人和動物具有毒害作用的次級代謝產物[1]，目前已知真菌毒素及其類似物有400余種，其中3/4已被證實對人類健康有影響[2]。據統計，全世界每年約有2%的農作物因污染嚴重而失去經濟和營養價值，造成極大的經濟損失和資源浪費，同時給人和動物食物安全帶來極大威脅，甚至會產生細胞毒性、免疫毒性及“三致”等毒副作用[3]。研究發現，人類和動物即使攝入微量的真菌毒素及其代謝物也會產生富集作用，危害健康。糧食作物中因多種產毒菌污染產生的協同毒性遠大于單種或多種毒素相加的作用[4]。因此，建立有效的真菌毒素污染監控至關重要，世界各國正逐漸強化對毒素污染的管理和防治，目前已有100余個國家和地區出臺食品中真菌毒素限量規定，極大地推動了真菌毒素檢測方法的發展和相關法規的規范。近年來，國內外研究者對真菌毒素進行了大量研究，為進一步深入研究真菌毒素的種類及其檢測技術，有效防控糧食作物的真菌毒素污染提供參考，從目前糧食作物中已發現的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等主要真菌毒素種類及其檢出限，以及真菌毒素檢測方法2方面對相關研究進展進行綜述。

1糧食作物中主要真菌毒素及其檢出限

1.1黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是一種由黃曲霉和寄生曲霉等代謝形成的有嚴重毒性的物質，已發現的衍生物多達20余種，常見的有AFB1和AFB2等，其中，AFB1的毒性最強，其毒性約是氰化鉀、砒霜等劇毒物質的幾十倍。AFB1可導致人和動物的急、慢性中毒，對肝臟、肺和腎臟等多種組織器官造成不可逆的損害，黃曲霉毒素是目前已知最強致癌物，具有很強的“三致”作用[1]，被世界衛生組織(WHO)列為I類致癌物。黃曲霉毒素性質穩定，在強酸及高溫等常見脫毒條件下難以完全分解。AFB1廣泛存在于玉米、花生等日常食用的糧油作物中，HACBEKIROGDU等[5]對采集的62種樣品進行黃曲霉毒素污染的檢測發現，毒素超標的樣品在75%以上，其中栗子等食品的毒素含量最大。目前，我國僅對部分食品中的AFB1和AFM1作限量規定[6]：小麥、大麥、小麥粉、麥片和其他谷物，豆類及其制品、其他熟制堅果及籽類中AFB1的最高允許限量≤5.0 μg/kg；稻谷、糙米和大米中AFB1≤10.0 μg/kg；玉米、玉米面(渣、片)及玉米制品，花生及其制品、花生油和玉米油中AFB1≤20.0 μg/kg；嬰幼兒配方食品中AFB1≤0.5 μg/kg；乳、乳制品和 (較大)嬰兒配方食品中AFM1≤0.5 μg/kg。對AFT總量等的限量標準仍需進一步探討。

1.2脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等產生的次級代謝產物，屬單端孢霉烯族化合物，具有強烈的毒性，可使人和動物產生惡心、嗜睡或嘔吐等急性中毒癥狀；若長期食用被DON污染的物質將造成細胞免疫反應功能障礙[7]、皮膚炎癥[8]、溶血性疾病及神經系統紊亂等損傷。DON對糧食污染的廣泛性是世界性問題，常見于小麥和玉米等農作物生長、儲運過程中。基于DON的嚴重危害性，世界各國或組織都對食品中DON的允許限量作出明確規定：中國規定小麥、玉米及制品中DON的最高允許限量≤1 000 μg/kg[6]；美國規定未清洗軟質小麥中DON≤2 000 μg/kg，食用小麥最終產品中DON≤1 000 μg/kg，飼料用小麥及其制品中DON≤4 000 μg/kg；歐盟規定小麥和燕麥中DON≤1 750 μg/kg，谷粉和玉米粉中DON≤750 μg/kg。

1.3玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由多種鐮刀菌產生的一種難溶于水，易溶于甲醇的非甾體雌激素樣作用的真菌毒素，亦稱F2毒素，其在霉變的玉米和高粱等谷類作物中廣泛存在，是污染范圍最廣的鐮刀菌毒素之一。因其毒性較強，在飼料和食品的加工過程中不易被破壞；能夠產生生殖毒性和細胞免疫毒性等，嚴重威脅人和動物的生命健康。各國或組織都對ZEN的限量標準作出具體規定：中國規定玉米類飼料中ZEN最高允許限量≤500 μg/kg，谷物(小麥、玉米)及其制品中ZEN≤60 μg/kg[6]；歐盟于2007年規定玉米和谷物中ZEN的最高允許限量分別≤350 μg/kg和≤100 μg/kg；澳大利亞規定黑麥中ZEN≤60 μg/kg。

1.4赭曲霉毒素

赭曲霉毒素(Ochratoxins，OT)是主要由赭曲霉、硫色曲霉等多種曲霉菌和鮮綠青霉產生的有毒次級代謝產物。赭曲霉毒素有 A、B、C和D 4種異構體，其中赭曲霉毒素A(OTA)在自然界中分布最廣泛[9]，毒副作用最強，人和動物食用含有OTA的食物易產生神經、免疫毒性等危害[10]。OT不僅能引起不可逆性的腎功能衰竭(大鼠經口LD50為20 mg/kg)[11]，還對肝臟、腎臟及泌尿系統具有“三致”作用，國際癌癥研究機構(IRAC)及世界衛生組織(WHO)將其列入2B類致癌物。目前，已有多個國家對OTA的限量作出規定：我國規定谷物、豆類及其制品中OTA的含量≤5 μg/kg[6]，瑞士規定谷物及其制品中OTA的含量≤2 μg/kg，巴西規定小麥、玉米、豆類OTA的含量≤50 μg/kg等。丹麥和法國規定谷物中OTA的含量≤5 μg/kg。

1.5伏馬毒素

伏馬毒素(fumonisin，FUM)主要是由串珠鐮刀菌和輪狀鐮刀菌產生的一類雙酯化合物的次級代謝產物，耐熱，遇酸后水解產物仍有部分毒性。伏馬毒素可對人和動物的神經系統、肺部和免疫系統造成極大損傷，并有較強的致癌性，致癌機理主要是髓鞘樣堿基的異常堆積，破壞DNA的正常合成[12]，國際癌癥研究機構(IRAC)將其歸為2B類致癌物。FUM廣泛分布在玉米、水稻等農作物中，目前已知的FUM衍生物有FA1和FB1等11種，其中FB1含量最高，毒性最強。美國規定玉米及其谷物制品中FUM最高允許限量≤1 000 μg/kg，嬰幼兒玉米制品谷物中FUM≤200 μg/kg；法國規定谷物中FUM≤1 000 μg/kg；我國尚未對FUM作出限量規定。有監測表明，我國部分地區的玉米、水稻中的FUM檢出率為28%～100%，最高含量達15.2 mg/kg[13]。

2真菌毒素的檢測

2.1定性檢測方法

2.1.1電子鼻分析法通過模擬動物嗅覺器官實現對氣味的有效識別及組分判斷，是一種比較前沿的定性分析方法。當前，通過此方法已能完成玉米和稻谷等糧油作物中赭曲霉毒素和嘔吐毒素等真菌毒素的特異性鑒別檢測，識別率≥80%，且此技術仍在不斷地研究優化，預計將來可在糧油真菌毒素監測中得到廣泛應用[14]。

2.1.2生物鑒定法通過在生物體上試驗判定真菌產生的危害，并對其毒性部位和毒性機理進行驗證，是一種比較傳統和直觀的定性分析法。常見的生物鑒定法有種子發芽試驗、皮膚毒性試驗和組織細胞培養試驗等，其具有對樣本純度要求較低的優點，但也存在精準度低、易污染，特異性、重復性及靈敏度不佳等缺點。故此法僅用作化學法等其他分析方法的輔助方法[15]。

2.1.3質譜成像分析法質譜成像技術(MSI)是一種簡單、高效的定性方法，其通過質譜離子掃描與成像技術結合測定，再對得到的目標物質荷比(m/z)信息進行分析、歸類[16]。SEBASTAIN等[17]采用基質輔助激光解吸-飛行時間質譜成像技術同時檢測鑒別被污染葡萄中的OTA及12種伏馬毒素，直觀地看到其污染程度和污染區域。BERISHA等[18]研究指出，采用激光解吸-高分辨質譜成像技術快速篩查鑒定小麥種子中的DON，樣品無需前處理，結果誤差<2×10-6μg/kg，且不受水分含量影響。MSI檢測步驟簡單、效率高，且可同時測定多種毒素污染的程度和分布，但由于進一步的確證和定量仍需借助其他檢測技術。因此，MSI在食品安全檢測中的應用尚不廣泛。

2.2定量檢測方法

2.2.1理化檢測法

1) 薄層色譜法(TLC法)。TLC法是一種最早被廣泛用于真菌毒素檢測的經典的化學分析方法，主要通過特征性的顯色反應和色譜保留規律，對樣品進行分離、定性和定量分析，該方法操作簡便快速，難度低，損耗低。AOAC首次提出用薄層色譜檢測法測定花生中的黃曲霉毒素[19]，后被多個國家認可并采納為標準方法。該方法在2009年以前曾長期作為我國真菌毒素檢測國標第一法。TEIXEIRA等[20]使用TLC法和電荷耦合檢測器(CCD)對88份紅酒樣品中的OTA污染情況進行篩查發現，其污染率為5.7%，該方法的定量限和檢測限分別為0.8 μg/L和0.2 μg/L，平均回收率為82.3%。TLC法雖可操作性高，但存在過程復雜、精密度差、結果易受主觀影響和無法實現自動化等缺點，目前已經難以適應當下日常檢測的需要。在一些實驗條件有限的情況下，TLC法在監測和分析研究等方面仍具有一定的優越性。快速的定性篩選判斷仍多采用此法。

2) 高效液相色譜法(HPLC法)。HPLC法是現代科學領域中重要的分離、分析技術，是以液體作為流動相，用顆粒極細的高效固定相進行成分分離的柱色譜技術。真菌毒素檢測廣泛地采用HPLC法，其檢測分離效能高，可同時檢測多種真菌毒素。HPLC法常與穩定快速的樣品前處理方法、衍生方法結合使用，免疫親和柱凈化法(IAC)是最有效的前處理方法，其原理是用抗原-抗體的免疫反應作為依據，利用單克隆抗體與目標真菌毒素的特異性吸附進行分離凈化。于彥彬等[21]將花生樣品通過固相萃取凈化后，采用柱后衍生-高效液相色譜法測定其中的4種黃曲霉毒素，回收率為68.8%～101%，RSD為5.0%～7.1%。謝剛等[22]通過研究自動化免疫親和在線凈化-HPLC法，實現樣品凈化和檢測同步化，且支持高通量樣品檢測，有效提高了樣品檢測的效率。由于HPLC法前處理過程復雜、經濟成本高，因此其雖靈敏度高，結果精確，但無法滿足大批量樣品的快速篩查。

3) 液相色譜-質譜法(LC-MS/MS法)。LC-MS/MS法兼具色譜法的高效分離和質譜檢測器的通用性，對真菌毒素檢測適用性廣、靈敏度高，可同時完成對多種毒素的檢測。MEERPOEL等[23]采用UPLC-MS法同時對食品、飼料中的OTA和柑桔素進行檢測，定量限分別為5.6 μg/kg和3.9 μg/kg，該方法的相關指標滿足歐盟No.401/2006/EC和No.2002/657/EC指令要求。STEFANOVIC等[24]對比ELISA法和高效液相色譜-質譜檢測技術(UPLC-MS)測定牛奶(n=250)中AFM1及玉米(n=100)中AFB1，回歸分析結果顯示，AFB1樣品之間的一致性(R2=0.994)高于AFM1樣品之間的一致性(R2=0.920)，進一步驗證了2種方法的適用性和可靠性。近年來，為了適應檢測需要，提高分析效率，常將實時直接分析技術(DART)與UPLC-MS法融合應用于食品真菌毒素的分析檢測。宮小明等[25]應用QuEChERS技術對紅酒樣品進行前處理后，直接進樣分析表明，在1.0 μg/kg、2.0 μg/kg和10 μg/kg 3個加標水平下，回收率為88.7%～105.7%，RSD為8.5%～12.8%，定量限為0.5 μg/kg。既方便省時，又減少溶劑污染，比較適合進行大批量的樣品檢測處理。

4) 氣相色譜檢測法(GC法)。GC法是利用惰性氣體將氣化的樣品帶入色譜柱中進行分離檢測，常用于具有良好氣化性能、弱熒光或弱吸收的真菌毒素檢測，具有分離效能高、方法靈敏度高、分析速度快和選擇性強等優點。YUE等[26]使用GC法分析中草藥及相關產品中的嘔吐毒素含量，檢出限為2 μg/kg，加標試驗回收率為85.5%～97.2%，RSD<6.3%，與GC-MS的測定結果一致，驗證了2種方法的適用性和可靠性。此外，GC法也是展青毒素、玉米赤霉烯酮和鏈格孢毒素的常用檢測方法[27]。

5) 氣相色譜-質譜法(GC-MS法)。GC-MS法利用物料在色譜柱中吸附性能的差異、極性及沸點不同進行分離和鑒定混合物，該法優點是抗干擾能力極強、高靈敏度、誤差小、回收率高且可同時檢測多種真菌毒素。TANG等[28]采用GC-MS技術測定谷物中DON含量，只需真空干燥和衍生化2步簡單前處理即可進樣分析，該法分析時間<15 min，對3-keto-DON、3-epi-DON和DON的檢測回收率為89.5%～103.6%，檢出限分別為5×10-11mg/L、3×10-9mg/L和8×10-10mg/L。但GC-MS法不適于鏈格孢霉毒素等穩定性強、難揮發的真菌毒素測定。

6) 超臨界流體色譜法(SFC法)。SFC法利用改變超臨界流體溶劑的溫度和壓力控制超臨界流體中不同組分的溶解度，從而達到分離、檢測待測物的目的。該法具有對環境友好和高效等特點，且在真菌毒素檢測過程中，能夠對不同真菌毒素異構體實現分離。MARTHE等[29]首次提出采用超高效-超臨界流體色譜串聯質譜的方法檢測啤酒中游離菌毒素和修飾菌毒素，成功測出啤酒樣品中的6種鐮刀菌毒素及其衍生物，為真菌毒素的檢測拓展了新思路。但此法保留機制復雜，洗脫不穩定，也限制了UPLC-SFC法在多菌毒素分析中的應用。LEI等[30]用異丙醇稀釋經13C標記的食用油樣品，再經乙腈-飽和己烷萃取，最后以超臨界CO2和甲醇作為流動相對萃取液進行梯度洗脫，此方法無需純化就能在30 min內對食用油中4種AFT完成檢測，其檢出限為0.05～0.12 mol/ L，RSD<8.5%，形成了一種新的基于超臨界流體色譜技術的測定法——SFC-MS/MS法，其在食品痕量分析領域潛力巨大。

2.2.2免疫化學法

1) 酶聯免疫法(ELISA法)。ELISA法是把酶的高效催化作用和抗體、抗原的免疫反應有機結合的一種顯色檢測技術，分為間接競爭和直接競爭酶聯免疫法2種形式[31]。馬冬月[32]建立農產品中嘔吐毒素的酶聯免疫檢測方法，其通過交叉反應試驗證明抗體具有較高的特異性，此法IC50的檢出限和靈敏度分別為 0.003 mg/kg和0.03 mg/kg。潘明飛等[33]建立了一種能夠快速檢測谷物食品中殘留AFB1的間接競爭酶聯免疫分析方法，成功檢測出花生樣品中的AFB1含量，檢出限為0.006 6 μg/L，靈敏度為0.027 μg/L。目前，酶聯免疫檢測技術已成為我國糧油食品中國標規定的真菌毒素篩選檢測方法，酶聯免疫法選擇特異性好、靈敏度高且操作簡單，但仍存在標記物酶易失活、重復性差、無法多毒素同時檢測，難以實現自動化及假陽性概率較高等缺點，且難以滿足越來越低的限量標準需求。

2) 時間分辨熒光免疫技術(TRFIA法)。TRFIA法是一種由光激發產生的均相化學發光技術，以稀土元素為熒光標記物，使用時間分辨熒光儀測定熒光信號強度，光信號強度與樣品中的分析物濃度成反比，對照標準曲線即可確定被測樣品中分析物的含量。與ELISA法相比，結果穩定性高。張兆威等[34]使用自制時間分辨熒光免疫層析試紙條對不同農產品的AFB1進行檢測發現，測定結果與HPLC法檢測結果相互驗證，檢測限為0.3 μg/kg。周彬等[35]利用DON多克隆抗體和光(680 nm)激發產生的均相化學發光技術，通過標記免疫反應建立起均相的DON-AlphaLISA免疫檢測法，測定的樣品光信號強度與 DON 濃度成反比，此法時間短，穩定性好，有效范圍更寬，為0.007～100 ng/mL，靈敏度為0.007 ng/mL，批內批間變異系數均<5%， 無明顯基質干擾。TRFIA法靈敏度高、重現效果佳且能一次測定多個樣品，不足點在于易受背景熒光的干擾且測定需要的試劑可能損害人體健康，務必要在嚴密的防護條件下進行操作。

3) 膠體金免疫層析技術(GICA法)。GICA法是將試紙條中的抗體與樣液中的特異性抗原結合顯色后，經膠體金標記，通過對試紙條顯色反應的深淺進行儀器對比讀取，從而確定真菌毒素的含量。其在當前的免疫學快速檢測方法中以操作簡便、時間短、靈敏度強及污染少等優點備受關注，常見于糧油食品在收購、加工和抽查復核過程中快速篩查真菌毒素。杜兵耀等[36]通過對比膠體金免疫層析技術和HPLC技術測定谷物樣品中AFB1的檢測結果發現，相符率在90%以上，檢測時間<5 min，適用于在田間地頭建立流動性高的實驗室，進行質量監測和大批量糧油食品的篩查檢測，但其仍存在樣品提取效率低，無法實現多樣品同時檢測等缺點，需要進一步優化。

4) 放射免疫測定技術(RIA法)。RIA法通過同位素標記靶標并加入特異性抗體檢測真菌毒素。閆磊等[37]建立了用CharmⅡ放射免疫法檢測牛奶樣品中AFT的流程法，通過18次陰性樣品空白試驗和加標試驗，結果全部與液相法交叉驗證，表明該方法靈敏度和精密度良好，檢出限為0.25 μg/kg。此法前處理簡單，測定周期短、效率高，但也容易對其他物質產生污染，成本較高，還需要更進一步的探究優化。

5) 橫向流動免疫檢測技術(LFD)。LFD的發展源于臨床分析中的大分子檢測，研究者利用橫向流動(LFD)原理研制出一種快速檢測OTA的免疫檢測方法：先通過篩選和交叉反應找出最優的OTA抗體，然后用染色的血清感光乳膠顆粒對抗體進行吸附固定，通過LFD中的測試線和質控線進行結果定性：2條線均存在時表明樣品很少或沒有OTA存在；僅有1條時表明樣品中有大量的OTA存在[38]。該方法可用于快速鑒別OTA的產毒真菌，對毒素的早期預防有重要意義。

2.2.3電化學生物傳感器法電化學生物傳感器法通過將生物與電子技術相結合，以物質在溶液中電化學性質規律變化為基礎，將微弱的生物化學反應信號轉變成可定量的物理、化學信號進行分析測定的一種方法。電化學生物傳感器法不僅能快速檢測組分復雜的樣品，且能連續分析被測物，擁有直觀高效、靈敏度高和特異性強等優勢，在食品工業領域有良好的應用前景。閆好杰等[39]自制一種核酸適體/捕獲探針DNA/羧基化多孔碳-納米金/氨基化金電極(Apt/c DNA/c PC-Au NPs/NH2-Au E)傳感器，以亞甲基藍為信號反應器，對OTA的檢測靈敏度顯著提升，檢測限為1.0×10-6ng/mL。DALY等[40]利用表面等離子共振(SPR)生物傳感器建立黃曲霉毒素的檢測方法，通過連續監測分析黃曲霉毒素偶聯物和抗黃曲霉毒素抗體作用時折光指數的變化檢測真菌毒素的含量，該方法在3～98 ng/mL對AFB1檢測具有良好的重復性。SCHNER等[41]用類似的生物傳感器檢測小麥中DON發現，其工作范圍在0.13～10 .00 μg/mL，檢測限為2.50 ng/mL，表明該方法檢測靈敏度較高。此外，還有以光纖倏逝波和以聲表面波為原理設計的傳感器，此傳感器檢測技術的應用，為新技術的研究拓寬了視野，但也存在成本較高和重復性差等缺點，仍需進一步優化。

2.2.4光譜分析法通過光譜分析法快速檢測和鑒別待測樣品中的真菌毒素類型，并據此進行定性和定量分析，常用于AFT和OTA等真菌毒素的現場檢測。該法能從空白樣品中篩選出DON污染值>310 mg/kg的樣品[42]。KOS等[43]采用中紅外(MIR)/衰減全反射(ATR)光譜測定玉米中霉菌毒素的分布情況，并采用完全交叉驗證法對最小二乘(PLS)回歸模型進行評估發現，經主成分分析/聚類分析(PCA / CA)分類后真菌毒素的分離效率為100%，PLS模型的交叉驗證顯示相關系數為r=0.992 6，無異常值。SENTHILKUMAR等[44]采用近紅外高光譜成像系統(NIR)對儲藏大麥OTA污染情況進行動態分析發現，其對大麥各時期OTA的污染程度分析準確性≥82%。QU等[45]建立了一種薄層色譜-表面增強拉曼光譜(TLC-SERS)檢測技術，用手提式拉曼光譜儀對薄層色譜分離的斑點進行定性、定量分析鑒別的結果表明，該法檢測時間<5 min，AFB1和AFG1檢測限分別為1.5×10-6mg/kg和1.2×10-6mg/kg，選擇性較高，目前已成功用于現場檢測。隨著中/近紅外(MIR/NIR)光譜技術的發展和數據模型的完善，光譜分析法將在真菌毒素檢測領域得到廣泛應用。

2.2.5蛋白芯片分析法蛋白芯片分析法是建立在微電子學和生命科學等多學科交叉基礎上的一種新方法，其由于分析時間短、多樣品參數同時處理及自動化程度高等方面的優勢，近年來已成為研究的熱點。宋慧君等[46]通過液相芯片技術平臺和間接競爭法原理，對偶聯抗原濃度進行優化，探索出AFB1抗原抗體結合的最佳反應時間和單抗臨界飽和濃度，建立起一套高效的定量檢測方法，靈敏度為2.33 ng/mL。

2.2.6熒光光度法熒光光度法是實驗室常見的一種分析技術，根據不同真菌毒素的熒光特性，可通過對樣品中真菌毒素的提取、純化，借助熒光分光光度計建立定性及定量分析方法。WANG等[47]利用摻氮碳點和納米銀熒光法，提高了熒光強度，對啤酒和面粉中的OTA進行快速測定的檢出限為8.7 nmol/L，有效擴寬了檢測范圍，縮短了測定時間。該檢測技術易普及、分析速度快、操作簡便且結果直觀，但也存在無法實現自動化的局限性[48]。

3小結

中國作為人口大國，更要重視糧食作物中真菌毒素對人生命健康的嚴重危害。伴隨著科學技術的快速發展和各學科前沿技術的交叉普及應用，真菌毒素檢測技術也不斷呈現出高效準確和簡便低耗的特點，該研究以國內外相關研究為參考，通過對常見真菌毒素的種類、特性及其檢出限要求和檢測分析技術進行較為全面的綜述，及時追蹤新方法、新技術的研究進展，不斷總結完善，探索適用于行業各層次的在線監測技術，可滿足市場對檢測方法提出的高效和準確需要，對加強我國食品安全的風險監控，保障行業高質量發展及消費者的身體健康，促進經濟社會的可持續發展具有重要意義。