中西藥聯用對雞源沙門氏菌的體外抗菌活性

樊國燕， 黃 慧， 李慧娟， 張立恒， 婁 飛， 王曉琳， 裴亞玲， 李榮譽

(河南牧業經濟學院， 河南 鄭州 450046)

抗菌藥物為畜禽健康養殖提供了重要保障，但大量、廣泛使用甚至濫用抗菌藥物導致強耐藥性的細菌出現和傳播，給公共衛生健康帶來巨大威脅。沙門氏菌、彎曲菌及金黃色葡萄球菌是感染畜禽的三類主要食源性致病菌，且畜禽源分離株對常用抗菌藥物的耐藥率已處于較高水平[1]。范忠軍等[2]研究表明， 56株雞源腸炎沙門氏菌分離株對22種抗生素表現出不同程度的耐藥性，其中對青霉素和紅霉素的耐藥性分別高達98.21%和96.43%。沈學懷等[3-5]研究均證實沙門氏菌(Salmonella)對大部分抗菌藥物的耐藥情況嚴重。 2017年主要臨床分離菌種分布前20位中，沙門氏菌排第19位，并且近幾年均排在前20位[6]。沙門氏菌的耐藥性問題在國外同樣引起重視，WHITE等[7]研究發現，美國腸道沙門氏菌亞種I型是與人類沙門氏菌病相關的5種最常見細菌型之一，主要表現為對氨芐西林、鏈霉素、磺胺類藥物和四環素的耐藥性，已成為一個公共衛生問題。WHITE等[7]調查發現，沙門氏菌確診和疑似感染源為活的動物環境、肉類和家禽以及寵物等，通過對食品安全和檢驗服務(FSIS)監管的肉類和家禽產品的分離物進行研究，在多個FSIS產品類別中均發現了低水平的耐藥沙門氏菌，表明該病原體的宿主范圍相對較廣。為探究沙門氏菌的耐藥機制，黃慧等[8]對18株臨床分離的沙門氏菌進行藥敏試驗及基因分子特征分析發現，有4株為耐藥菌株，耐藥率22.2%，說明沙門氏菌對恩諾沙星產生耐藥性與gyrA基因突變密切相關，gyrA基因喹諾酮耐藥區(QRDR)的雙突變可使沙門氏菌對恩諾沙星的耐藥性增強。

為探求解決細菌耐藥性問題，人們不斷尋找抗生素替代品，具有抗菌作用的中藥有望成為獸用抗菌藥物替代品之一。不過許多中草藥雖然具有抗菌活性，但單獨應用起效較慢，抗菌活性相對不強，中藥單獨用于獸醫臨床效果還不太理想，中藥與抗菌西藥合理聯合應用可以提高療效，降低化學合成抗菌藥物或抗生素的用量，消除或逆轉耐藥現象[9]，可取得單獨使用中藥或抗菌藥所不能取得的治療效果。藥物組合可以幫助有機體對抗多重耐藥(MDR)細菌感染[10]。為探索中藥、西藥聯合應用的抑菌效果，以雞源沙門氏菌為試驗菌株，選用黃芩、黃連、大黃、恩諾沙星、鹽酸環丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星幾種藥物，分別單獨或采用不同中西藥組合進行體外抑菌效果試驗，以期篩選出與西藥具有協同抗菌作用的中藥，為獸醫臨床用藥提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1中藥和西藥品種中藥品種3個，分別為黃芩、黃連和大黃，均購自北京同仁堂大藥房。西藥品種4個，分別為恩諾沙星(含量99.5%，批號DK03-1806235，上虞京新藥業有限公司)，鹽酸環丙沙星(含量88.5%，批號DK15-1712241-6，上虞京新藥業有限公司)、硫酸阿米卡星(653 U/mg，批號 20160413，浙江永寧藥業股份有限公司)、硫酸新霉素(651 U/mg，批號 201708007，宜昌三峽制藥有限公司)。

1.1.2試驗菌株雞源沙門氏菌菌株，由河南農業大學牧醫工程學院獸醫藥理學實驗室從河南地區養殖場分離、鑒定、保存。質控菌大腸桿菌(ATCC?25922)由河南農業大學饋贈。

1.1.3主要儀器可見分光光度計(型號VIS-7220G，北京萊伯泰科儀器有限公司)，立式高壓蒸汽滅菌鍋(型號LDZX-50KBS，上海申安醫療器械廠)，分析天平(型號BSA224S，賽多利斯科學儀器有限公司)，振蕩培養箱(型號YKC-100B)，恒溫培養箱(型號LRH-250)，潔凈工作臺(型號JJ-CJ-2FD)，96孔V型板，微量移液槍(100 μL、200 μL、1 000 μL)，八連排槍 200 μL。

1.2方法

1.2.1中藥水提液制備采用水煎法制備中藥水提液，將黃芩、黃連、大黃各取100 g，加純化水1 000 mL，浸泡30 min，煎煮1 h，紗布過濾；濾液保存，濾渣加純化水600 mL，煎煮30 min，紗布過濾；合并兩濾液，文火濃縮至100 mL，得濃度為1 g/mL的藥液；高壓滅菌，冰箱4℃保存備用。

1.2.2西藥藥液制備精密稱取硫酸新霉素、硫酸阿米卡星、鹽酸環丙沙星適量，分別置于50 mL容量瓶中，用適量水溶解，定容；精密稱取恩諾沙星適量，置于50 mL容量瓶中，加入1/2體積的水后，逐滴加1 mol/L的NaOH至最終溶解，加水定容；新霉素、阿米卡星、環丙沙星、恩諾沙星計，藥物最終濃度均為1 280 μg/mL。藥液配成后，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝在EP管內，冰箱4℃保存備用。

1.2.3菌種復蘇及菌液制備

1) 菌種復蘇。取沙門氏菌菌種 50 μL接種于5 mL的LB 肉湯中，于35℃、220 r/min震蕩培養過夜，得復蘇菌液；挑取新鮮復蘇的菌液接種于LB瓊脂培養板上，35℃倒置培養16～18 h，菌種復蘇。

2) 菌液制備。菌種復蘇后，用接種環蘸取3～4 個單菌落接種于LB肉湯，于35℃、220 r/min 震蕩培養8～12 h，培養過程中，每隔20 min用紫外分光光度計測1次菌液的OD625值；當菌液OD625值在0.08～0.13時(菌液濃度約為 1×108cfu/mL)，將菌液用MH 肉湯按 1∶1 000 稀釋，備用。

1.2.4單藥最小抑菌濃度(MIC)測定及結果判定采用96孔V型滅菌反應板，用微量肉湯二倍稀釋法[11]測定黃芩、黃連、大黃、恩諾沙星、鹽酸環丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星對雞沙門氏菌的單藥最小抑菌濃度(MIC)值，同法測定質控菌的MIC值，重復3次。以美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗執行標準(2017年版)[12]為參考(表1)，比較質控菌對西藥的MIC值是否符合要求，判定試驗菌株對抗菌藥的敏感性。參照李東等[13]的判定標準判斷試驗菌株對中藥的敏感性，MIC>250 mg/mL為不敏感，MIC在125～250 mg/mL為低敏，MIC15.63～62.5 mg/mL為中敏，MIC≤7.81 mg/mL為高敏。根據4種西藥對質控菌的MIC測定值，均在質控菌MIC允許范圍內，說明試驗條件符合要求。

表1 受試菌對4種西藥敏感性及判定標準

1.2.5聯合用藥部分抑菌濃度(FIC)指數測定與結果判定采用微量肉湯棋盤稀釋法[11]測定聯合用藥的FIC指數。根據測得的單藥對試驗菌株的MIC值，以抗菌藥MIC的16倍、8倍、4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍濃度分別進行聯合，并設中藥、西藥單藥對照及細菌對照，測定聯合用藥對雞沙門氏菌的抗菌效果，以FIC指數為聯合藥敏試驗的判斷依據。判斷標準[14]：FIC指數≤0.5為協同作用，0.52為拮抗作用。

2結果與分析

2.1沙門氏菌對抗菌中藥和西藥的敏感性

從表2看出，試驗菌株對選用的抗菌西藥硫酸新霉素、硫酸阿米卡星比較敏感，對恩諾沙星、鹽酸環丙沙星均表現耐藥。說明一些抗菌藥物已經出現了耐藥現象，所以在臨床上應考慮抗菌藥物的選擇及其合理應用，以減輕細菌的耐藥。試驗菌株3種抗菌中藥敏感程度不同，其中，黃連的抗菌效果最佳，屬于高敏；黃芩次之，大黃也具有一定的敏感性。由此看出，選用中藥作為抗菌藥是可行的，但在臨床上對于中藥抗菌藥物的選擇時，應進行藥物敏感性試驗，以達到理想的抗菌效果。

表2 雞沙門氏菌對抗菌西藥和中藥的敏感性

2.2抗菌中藥和西藥聯合使用對沙門氏菌的抗菌作用

從表3看出，4種抗菌西藥與3種抗菌中藥組成的藥物組合中，呈協同作用的有3組，分別為恩諾沙星+黃芩，恩諾沙星+黃連和鹽酸環丙沙星+黃連；呈相加作用的有2組，分別為硫酸新霉素+黃連和硫酸阿米卡星+黃連；呈無關作用的有2組，分別為恩諾沙星+大黃和鹽酸環丙沙星+大黃；其余4組表現為拮抗作用。由此看出，抗菌西藥與抗菌中藥聯合應用對病原菌的抗菌效果有協同相加、無關和拮抗作用。因此，在臨床藥物選擇上，應考慮藥物之間的合理配置，充分發揮中、西藥聯用的抗菌效果。

表3 抗菌中藥與西藥聯用對雞源沙門氏菌的抗菌效果

3結論與討論

細菌耐藥性已越來越引起人們的關注，且政府部門也采取了相應的措施，禁抗、限抗已提上日程。為此，加大細菌耐藥性機制的研究，建立快速檢測方法，篩選抗菌中藥均不失為一種很好的應對措施。中藥作為我國的瑰寶，在畜禽養殖方面的應用也日趨廣泛，其抗菌活性的研究重視度也越來越高。研究結果顯示，黃芩、黃連、大黃對雞源沙門氏菌均具有一定的體外抑菌效果，但敏感程度不同，與倪吉榮[15]的研究結論相同。王明英等[16]研究也證實，杜仲葉提取液對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌敏感程度不同，而對變形桿菌和枯草桿菌不敏感。由于不同的中藥其敏感程度不同，在選擇中藥作為抗菌藥時，應根據不同的致病菌選擇不同的中藥，同時對其抑菌效果進行考察，以確保治療效果，為獸醫臨床上選擇中藥抗菌藥提供參考依據。

中藥與西藥聯用試驗結果出現了協同、相加、無關甚至拮抗的情況。朱利霞等[17]分析中草藥與抗生素聯用對狐貍源大腸桿菌的體外抑菌效果，也出現了相同情況。王洪彬等[18]進行的中西藥聯用對舌鰨源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果研究，則出現了拮抗、無關、相加，沒有出現協同效應，與筆者等進行的的硫酸阿米卡星與黃芩、黃連、大黃3種中藥聯用試驗結果類似。而硫酸新霉素、硫酸阿米卡星分別與大黃、黃芩聯用后出現拮抗作用，原因可能是2種藥混合，發生了物理或化學性質的改變，其產生的機理還需進一步研究。中西藥聯用不一定都會出現協同作用，BROCHADO等[19]認為，拮抗作用僅發生在靶向不同細胞進程的藥物之間，而協同作用經常發生在靶標相同細胞過程的藥物之間。據此推斷，產生無關或拮抗作用的原因可能是2種藥物的作用位點不同所致。在中西藥聯合應用時，應進行FIC指數檢測，以選擇具有協同作用的藥物組合，進而達到理想的抑菌效果。

中藥抗菌藥一直被認為是安全低殘留的藥物，且是限抗、減抗替代品的最佳選擇。但張炳亮等[20]研究表明，其研究的23株豬源大腸桿菌對測試的中藥均有不同程度的耐藥性，試驗菌株對甘草耐藥率高達82.6%，生地耐藥率達78.2%。研究雖未出現中藥耐藥的情況，但理論上出現中藥耐藥性是可能的。據此可以看出，中藥使用不當，同樣會出現耐藥情況。因此，在使用中藥作為抗菌藥時對其產生的耐藥性也應引起高度重視。

致謝：試驗部分內容由河南牧業經濟學院動物藥學專業學生馬佩文、王磊磊完成，在此一并感謝！