MAP3K1-3UTR基因表達載體的構建及雙熒光素酶技術驗證

張雪婷?莫榮纖?張濤杰

摘要：目的 通過雙熒光素酶技術驗證MAP3K1-3UTR基因表達的作用，從而研究凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡的分子機制。方法 根據NCBI在線設計引物獲取目的基因，將雙熒光素酶載體分別插入MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突變型（MAP3K1-3UTR-MU）片段，構建psicheck2-MAP3K1-3UTR-WT和psicheck2-MAP3K1-3UTR-MU雙熒光素酶報告質粒，將重組之后的雙熒光素酶報告質粒轉染293T細胞，檢測雙熒光素酶的活性。結果 經過酶切和基因測序技術，成功構建MAP3K1-3UTR-WT和MAP3K1-3UTR-MU的雙熒光素酶報告質粒。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型與psicheck2-MAP3K1-3UTR突變型相比，熒光素酶活性明顯降低。結論 MAP3K1-3UTR基因可能與綿羊卵泡細胞的閉鎖和凋亡有關。

關鍵詞：MAP3K1;卵泡顆粒細胞;基因表達;雙熒光素酶

引言

卵泡是雌性動物繁殖的重要物質基礎，卵泡是由卵母細胞及其周圍顆粒細胞（granulosa cells，GCs）組成。顆粒細胞是構成卵泡的最大細胞群，它們以自分泌和旁分泌的方式調節卵泡的生長、發育和成熟，顆粒細胞可被認為是卵泡的支持細胞。顆粒細胞可促進卵巢合成和分泌抑制素、雌激素以及孕激素，為卵母細胞的成熟提供微環境，并維持黃體功能[2，3]。有研究表明，當顆粒細胞能力減弱或凋亡時，激素和生長因子的分泌將減少，甚至發生卵泡閉鎖 [4]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK家族）調節細胞的生長、分化、凋亡等多種生理病理過程，所有真核細胞都能表達，由三類蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK組成。MAP3KS一共有24種（MAP3K1至MAP3K21加上RAF1，BRAF和ARAF） [1]。MAP3K1是其中一種分子量為196-kDa的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可以被各種刺激和細胞應激（包括生長因子，細胞因子和微管破壞）激活，這是MAPK家族級聯激活第一步[6]。其編碼MEKK1蛋白是MAPK信號通路中的重要一員[5]，調控JNK、ERK1/2、P38等信號通路[7，8]。細胞凋亡受到生殖激素、微小RNA（microRNA， miRNA）、細胞因子和凋亡相關因子等因素的影響，其生殖激素（如FSH、褪黑素、E2和LH等）對卵泡發育和凋亡起主要作用。然而，這些凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡有何作用尚不清楚。因此本文通過構建MAP3K1-3UTR基因表達載體來研究其在細胞凋亡中的分子機制。

一、實驗目的

構建MAP3K1-3UTR基因的psicheck2-MAP3K1-3UTR表達載體，來研究凋亡因子對綿羊卵泡閉鎖和凋亡的分子機制。

二、實驗材料與方法

（一）實驗材料

靶基因名稱：MAP3K1基因。

表達載體：psicheck2載體。

293T細胞株，E.coli DH5α Chemical Competent Cell（上海吉凱基因化學技術有限公司），高糖DMEM、小牛血清（美國Hyclone公司），限制性內切酶（美國NEB公司），ClonExpress TM Ⅱ One Step Cloning Kit（中國南京，Vazyme）， T4 DNA Ligase、PrimeSTAR HS DNA polymerase（日本Takara 公司），POLO deliverer 3000（上海瑞賽生物技術有限公司），TRIzol Reagent（invitrogen），

（二）實驗步驟

1.引物設計

針對MAP3K1-3UTR基因的CDS區序列NCBI在線設計并合成PCR 引物（見表1）。

2.目的基因獲取化學（化學合成）

根據NCBI上獲得的MAP3K1-3UTR基因的CDS區序列，設計并化學合成涵蓋psicheck2載體結合位點的MAP3K1基因野生型（MAP3K1-3UTR-WT）和突變型（MAP3K1-3UTR-MU）片段。

3. 雙熒光素酶報告基因載體構建

（1）目的基因及目的載體的酶切

將目的基因和目的載體用xhoI和NotI分別進行酶切，酶切體系如下：

37℃酶切4-5小時后，電泳分離酶切片段，可以看到在418bp位置處出現兩個特異性條帶與目的基因相符，切膠回收目的片段。如圖二

（2）目的片段的與目的載體的連接

使用T4 DNA ligase 連接上述酶切后的PCR產物及目的載體，連接體系如下：

22 oC連接1小時。將10ul連接產物轉化DH5α感受態細胞，并涂布于含抗性的LB平皿，在37oC下培養過夜。次日，挑取單菌落進行菌落PCR，PCR擴增體系及循環程序如下：

將PCR鑒定呈陽性的克隆接到LB液體培養基中，搖菌過夜，次日抽提質粒。將菌落PCR呈陽性的克隆送測序，并進行序列比對。

4.雙熒光素酶載體轉染293T細胞

制備293T細胞懸液，接種于12孔培養板，在37℃、5%的CO2培養箱培養至細胞匯合度約為 80%，將psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（野生型和突變型）質粒分別轉染293T細胞。

三、實驗結果

（一）psicheck2載體圖譜如下：

（二）目的片段酶切

泳道1：目的片段MAP3K1-wt 酶切;

泳道2：目的片段MAP3K1-mu 酶切;

泳道3：Marker DL5000

（三）重組克隆的菌落PCR鑒定

泳道1：Marker DL2000

泳道2-8：基因全長引物對重組子PCR擴增（MAP3K1-WT）;

泳道9-15：基因全長引物對重組子PCR擴增（MAP3K1-MU）

（四） psicheck2-MAP3K1-3UTR載體對293T細胞的轉染效果

48小時后，熒光表達強度趨于穩定狀態，在倒置熒光顯微鏡下觀察。psicheck2-MAP3K1-3UTR野生型與psicheck2-MAP3K1-3UTR突變型相比，熒光素酶活性明顯降低。

psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（野生型）

psicheck2-MAP3K1-3UTR載體（突變型）

四、討論

卵泡閉鎖發生的原因之一是顆粒細胞的凋亡，這在許多動物身上已得到了證實。而卵泡閉鎖會對卵巢的發育產生一定的影響，從而影響到動物的繁殖。MAP3K1-3UTR基因指導細胞的生長，分化，遷移，對顆粒細胞是否會發生凋亡產生重要影響。

MAP3K1-3UTR基因所編碼的MEKK1蛋白具有重要的生物學功能，是MAPK家族幾種傳導信號的上游調節因子[9]，幾種研究表明MAP3K1-3UTR決定著細胞的命運，雙熒光素酶報告數據顯示抑制MAP3K1-3UTR基因的表達后，雙熒光素酶的活性明顯降低，說明該基因能夠控制細胞的能力。為之后進一步研究細胞凋亡的分子機制奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Leticia Cuarental，David Sucunza-Sáenz，Lara Vali?o-Rivas，Beatriz Fernandez-Fernandez，Ana Belen Sanz，Alberto Ortiz，Juan José Vaquero，Maria Dolores Sanchez-Ni?o. MAP3K kinases and kidney injury[J]. NEFROLOGíA，2019，39（6）.

[2]金艷梅.顆粒細胞對卵泡發育的影響[J].中國畜牧獸醫，2010，37（08）：69-72.

[3]Eppig J J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals.[J]. Reproduction，2001，122（6）.

[4]Manabe Noboru，Goto Yasufumi，Matsuda-Minehata Fuko，Inoue Naoko，Maeda Akihisa，Sakamaki Kazuhiro，Miyano Takashi. Regulation mechanism of selective atresia in porcine follicles： regulation of granulosa cell apoptosis during atresia.[J]. Journal of Reproduction and Development，2004，50（5）.

[5]景瑾，劉莉莉，尤杰，夏婷婷，張進，劉春，朱順星.Map3k1基因下調對B6小鼠眼瞼角質形成細胞增殖和遷移能力的影響[J].重慶醫學，2018，47（09）：1165-1168.

[6]Wang Jia，Zuo Jie，Wahafu Alafate，Wang Mao-de，Li Rui-Chun，Xie Wan-Fu. Combined elevation of TRIB2 and MAP3K1 indicates poor prognosis and chemoresistance to temozolomide in glioblastoma.[J]. CNS neuroscience & therapeutics，2019.

[7]Witowsky James A，Johnson Gary L. Ubiquitylation of MEKK1 inhibits its phosphorylation of MKK1 and MKK4 and activation of the ERK1/2 and JNK pathways.[J]. Journal of Biological Chemistry，2002，278（3）.

[8]蘇富琴，陳曉光.MEKK1在腫瘤MAPK信號傳導通路中作用的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16（07）：555-558.

[9]鄭良鳳，王勝潔，吳劉成，劉春，李瑤，邵義祥.MEKK1在B6-Co小鼠胚胎發育過程中的表達[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（01）：1-4+211.

作者簡介：

張雪婷（1999-06-01），河北省石家莊市，單位：西北民族大學，研究方向：動物生殖生理（自然科學類）。

莫榮纖（1999-03-），貴州省凱里市，單位：西北民族大學，研究方向：生殖生理。

通訊作者：張濤杰（1983-12-），甘肅臨洮，臨床獸醫學，西北民族大學。

項目名稱：miRNA-let-7b對卵巢癌細胞株SKOV3的增殖的影響以及作用機制

項目編號：XBMU-BYL19140.