梅毒螺旋體熒光定量PCR檢測方法的建立

譚麗娜

梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播疾病，該疾病主要通過性接觸、母嬰、血液等方式及新型傳播，該疾病鑒于不同的臨床表現可分為一二三期梅毒，同時也有部分處于潛伏期和胎帶傳播，目前該疾病已經被列入《中華人名共和國傳染病防治法》中，是明確防治管理的疾病，在我國的性傳播疾病監測系統當中，梅毒的傳染率增長速度最快。該疾病診斷的方法較多，其中梅毒螺旋體熒光測量定量PCR檢測是常見的方法之一。

梅毒疾病經大量臨床治療驗證，確定具有明顯的傳染性，同時對身體危害極大，早期快速準確的診斷能夠為臨床的治療提供有效的參考信息，在過去的檢查當中，由于梅毒分為不同時期，有的梅毒期特異性表現不高， 很多檢測出現假陽性、假陰性的情況，導致誤診以及漏診。

梅毒螺旋體熒光測量定量PCR檢測是梅毒分子生物學發展的重要成就，在梅毒的分子生物學當中，主要以探究梅毒的發病激勵和血清學診斷優化為發展目的。研究中發現，梅毒螺旋體中，TPN47片段廣泛存在于基因當中，對檢測的反應具有極高的靈敏性以及特異性。要對TPN47進行檢測，就需要有效設計檢測引物，并通過有效的驗證方式驗證其存在于梅毒螺旋體基因中。

TPN47是TP當中具有特異性較高的外膜脂蛋白抗原，經過大量研究發現，現存絕大部分TP菌株中均存在TPN47基因，并且該基因序列具有極強的穩定性，氨基酸序列與核苷酸高度保守，在梅毒I、II期當中能夠與患者發生高度反應，即使是在梅毒晚期也能夠檢測得到明顯的TPN47抗體，因此該抗原成了生產試劑盒的首要選擇。

綜合以上知識，為觀察TPN47，需要建立梅毒螺旋體熒光測量定量PCR檢測，方法如下。

檢測方法設備及試劑：當前該方法使用的設備多為引入的PCR擴增儀或者凝膠成像儀系統，而試劑盒為基因組TagDNA聚合酶、DNA提取試劑盒、大腸桿菌菌株、10×buffer等，其中最重要的是梅毒螺旋體標準株基因組，本基因組為疾控中心嚴格保存。

檢測方法建立步驟如下：（1）基因組DNA有效提取、引物與探針設計及合成;（2）熒光定量PCR擴增的建立;（3）熒光定量PCR靈敏性與特異性檢測;（4）樣本檢測;（5）普通PCR驗證。具體內容如下。

第一步為基因組DNA有效提取、引物與探針設計及合成：該步驟首先利用DNA試劑盒從菌液中有效提取出基因組DNA，嚴格保存，隨后設計用于拓展TPA47基因的引物，引物的上下游序列需要相互配對，用于普通PCR或者熒光定量PCR當中，實現擴增梅毒螺旋體TPN47雞引種的164bp堿基DNA片段的目的。該步驟中引物制作與探針的序列需要嚴格區分，以免制作失敗。

第二步為熒光定量PCR擴增的建立：建立熒光定量PCR檢測用于鑒定收集的血液樣本，在此之前需要建立反應體系，包括DNA模板、下游引物、上游引物、primix混合液、探針、PCR master、MIX，進行PCR擴增，即94℃4min、94℃1min、60℃1min、72℃1min，上述參數進行循環，循環次數為40次，隨后采用72℃延伸7min左右，完成熒光定量PCR擴增建立。

第三步為熒光定量PCR靈敏性與特異性的檢測：為了實現質粒濃度進行有效檢測，使用核酸檢測儀對標準菌株的，標準品進行10×稀釋，確認線性范圍為107-101，規范工作環境及工作步驟，確保檢測條件達到標準。隨后在最佳檢測條件下，利用不同擴增濃度標準品為比照模板，檢查有效靈敏度。再對大腸桿菌基因組DNA以及梅毒螺旋體基因組DNA為模板進行同樣操作，隨后對比分析靈敏性與特異性。

第四步為樣本的檢查：利用已經建立的熒光定量PCR監測方法對收集到的檢測樣本進行有效檢測，檢測目標位梅毒螺旋體外模脂蛋白TPN47，通過對該基因段進行檢測，并利用標準菌株進行洋相對照，觀察樣本是否呈陽性。

第五步為普通PCR測定，該步驟的采用是為對比熒光定量測定PCR檢查的效果，為有效驗證梅毒螺旋體的合成引物擴增片段是否來源于梅毒螺旋體DNA基因。需要選取部分經過熒光定量PCR監測方法的陰性和陽性樣本采用常規普通PCR檢查方法進行檢驗

通過梅毒螺旋體熒光測量定量PCR檢測方法，能夠判斷檢測所得片段是否是屬于梅毒螺旋體，而同時對特異性以及靈敏度的檢測則可以判斷梅毒螺旋體TPN47基因是存在于不同的梅毒螺旋體當中的。隨著科學的不斷發展，對于類似梅毒病毒的分子生物學發展將越來越快，靈敏性好、特異性高、操作簡便、容易實現試驗檢測自動化與標準化的方法將越來越多，為病毒性疾病的診斷和防治提供更加準確有用的信息。