辣椒素及二氫辣椒素對神經膠質瘤C6細胞和骨肉瘤ROS 17/2.8細胞的抑制作用

謝 樂，周 慎*，伍大華，劉 冬，向光紅，唐 濤，唐勁天

（1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院腦病科，湖南 長沙410006；3.貴陽中醫學院，貴州 貴陽550002；4.湖南省腦科醫院神經內科，湖南 長沙410007；5.北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京100192；6.清華大學工程物理系醫學物理與工程研究所，北京100084）

辣椒被亞洲和南美洲等世界各地廣泛食用，其產生辣味的物質統稱為辣椒素類似物， 屬于香草酰胺類生物堿，包括辣椒素（Capsacin，Cap）、二氫辣椒素（Dihydrocapsaicin，DHC）、高辣椒素、高二氫辣椒素、降二氫辣椒素等。 其中辣椒素以及二氫辣椒素是辣椒呈辣味的主要成分， 占辣椒素類似物的90%[1]。現代藥理學研究表明辣椒素以及二氫辣椒素能鎮痛、抗炎、止癢、降壓、調脂及抗癌等[2-3]，隨著研究的深入， 辣椒素抗腫瘤作用正逐漸成為研究的熱點。已有研究報道辣椒素對肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等[4-6]多種癌細胞具有抑制作用，本文報道辣椒素及二氫辣椒素對大鼠神經膠質瘤C6 細胞、 骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞增殖的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試藥與儀器

辣椒素、二氫辣椒素（美國sigma，純度99%）；大鼠神經膠質瘤C6 細胞、骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心）；DMEM 培養基（美國Gibco BRL）、牛胎血清、L-谷氨酰胺、HEPES、 二甲基亞砜（美國Thermo 公司）、CCK-8（日本同仁化學研究所）、活性氧檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）、CO2細胞培養箱（美國Thermo 公司）、酶聯免疫檢測儀 （美國BIO-RAD 公司，BIO-RAD 680 型）、BD Calibur 型流式細胞分析儀（美國BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將C6、ROS17/2.8 細胞接種于含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、2 mmol/L HEPES 的DMEM 培養基中。 在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，取對數期生長良好的細胞進行實驗。

1.2.2 CCK-8 法檢測辣椒素及二氫辣椒素對C6 細胞、ROS17/2.8 細胞的抑制作用 辣椒素以及二氫辣椒素分別溶解于含0.5%DMSO 的DMEM 培養基中。 取對數生長期的細胞， 調整細胞濃度為5×104/mL，在無菌96 孔培養板中每孔加入100 μL 細胞懸浮液，37 ℃孵箱中培養24 h 后， 吸棄培養基，分別加入濃度為50、100、150、200 μmol/L 的Cap/DHC 培養液，另設溶劑對照組（含0.5%DMSO 的細胞培養液100 μL） 及空白對照組 （細胞培養液100 μL）， 每組設6個復孔。 分別繼續培養12、24、48、72 h 后檢測細胞抑制率。吸棄培養液，每孔加入含10 μL CCK-8 的細胞培養液100 μL，繼續培養2 h 后， 用酶標儀檢測450 nm 波長的吸光度（OD值），計算細胞抑制率。

細胞抑制率（%）=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

As：實驗孔（含有細胞的培養液、CCK-8、藥物），Ac：對照孔（含有細胞的培養液、CCK-8、不含藥物），Ab：空白孔（不含細胞和藥物的培養液、CCK-8）。

1.2.3 辣椒素及二氫辣椒素對C6 細胞凋亡率的檢測 取對數生長期的C6 細胞， 調細胞濃度為1×105個/mL，接種于6 孔細胞培養板，每孔含細胞懸浮液2 mL。37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h 后加入200 μmol/L 的Cap/DHC。 繼續培養12 h 后，收集細胞，PBS 洗滌2 次，重新懸浮細胞并計數，取含5×105個細胞的懸浮液，1 000 r/min 離心5 min 后棄上清，加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞， 再加入5 μL Annexin V-FITC 及5 μL PI，混勻，室溫，避光反應5～15 min， 用流式細胞儀檢測平均熒光強度（MFI），激發波長488 nm；發射波長530 nm。

1.2.4 辣椒素及二氫辣椒素對C6 細胞活性氧自由基（ROS）的影響 取對數生長期的C6 細胞，調細胞濃度為1×105個/mL，接種于6 孔細胞培養板，每孔含 細 胞 懸 浮 液2 mL。 培 養24 h 后， 加 入200 μmol/L 的Cap/DHC，繼續培養12 h，吸棄培養液，加入含有10 μmol/Lol/L DCFH-DA（二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯） 的無血清細胞培養液1 mL，37 ℃細胞培養箱內孵育20 min。 用無血清細胞培養液洗滌3 次，充分除去未進入細胞的DCFH-DA。收集細胞，用PBS 重懸并計數，取含2×105個細胞的懸浮液，用流式細胞儀檢測，激發波長488 nm。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CCK-8 法檢測辣椒素及二氫辣椒素對大鼠神經膠質瘤C6 細胞的抑制作用

CCK-8 實驗結果顯示，Cap/DHC 對大鼠神經膠質瘤C6 細胞具有良好抑制作用， 且與時間和濃度呈正相關。在12 h 后Cap/DHC 對C6 細胞的抑制作用即具有統計學意義，在72 h 后，Cap/DHC 對大鼠神經膠質瘤C6 細胞的抑制作用最強， 分別為Cap（200 μmol/L）80.29%， DHC（200 μmol/L）73.92%，見圖1-A、B， 說明Cap/DHC 對大鼠神經膠質瘤C6細胞具有良好的抑制作用。 溶劑對照組（0.5%DMSO）的抑制率始終在5%以下，且與空白對照組相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1-A 辣椒素對大鼠神經膠質瘤C6 細胞增殖的抑制作用（n=5，±s）

圖1-B 二氫辣椒素對大鼠神經膠質瘤C6 細胞增殖的抑制作用（n=5，±s）

2.2 CCK-8 法檢測辣椒素及二氫辣椒素對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞的抑制作用

CCK-8 實驗結果顯示，隨作用時間和Cap/DHC濃度的變化，Cap/DHC 對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞抑制作用隨時間和濃度的增加而逐漸增強。 在12 h 后Cap/DHC 對C6 細胞的抑制作用即具有統計學意義，在72 h 后，Cap/DHC 對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞的抑制作用達到最大， 分別為： Cap(200 μmol/L）67.27%，DHC(200 μmol/L）66.14%，見圖2-A、B， 說明Cap/DHC 對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞具有較好的抑制作用。 溶劑對照組（0.5%DMSO）的抑制率始終在5%以下，且與空白對照組相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2-A 辣椒素對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞增殖的抑制作用（n=5，±s）

圖2-B 二氫辣椒素對大鼠骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞增殖的抑制作用（n=5，±s）

2.3 辣椒素及二氫辣椒素促進C6 細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果顯示， 經Cap/DHC 處理12 h 后，C6 細胞存活率 明顯下降， 由 （81.18±3.254）%分 別 下 降 至25.847%（Cap，200 μmol/L）、18.743%（DHC，200 μmol/L）， 早期凋亡率顯著增加，晚期凋亡率無明顯變化，說明Cap/DHC 能促進C6 細胞發生早期凋亡。 見表1、圖3。

2.4 辣椒素及二氫辣椒素提高C6 細胞內ROS水平

流式細胞儀檢測結果表明， 經Cap/DHC 處理12 h 后，C6 細胞內ROS 的熒光強度明顯增加，波峰右移，提示Cap/DHC 處理后C6 細胞內ROS 水平明顯升高，統計分析后MFI 之間的差異具有顯著統計學意義（P＜0.01）。 見表2，圖3。

表1 辣椒素及二氫辣椒素處理12 h 后對C6 細胞凋亡的影響 （n=3，±s，%）

表1 辣椒素及二氫辣椒素處理12 h 后對C6 細胞凋亡的影響 （n=3，±s，%）

注：與對照組比較**P＜0.01。 下表同。

組 別Control Cap（200 μmol/L）DHC（200 μmol/L）存活率81.18±3.254 25.847±4.464**18.743±6.494**早期凋亡率6.233±3.367 63.807±6.338**69.317±9.852**晚期凋亡率12.587±2.745 10.347±2.914 11.940±3.376

表2 辣椒素及二氫辣椒素處理12 h 后C6 細胞內ROS 含量的比較 （n=3，±s）

表2 辣椒素及二氫辣椒素處理12 h 后C6 細胞內ROS 含量的比較 （n=3，±s）

MFI 2.603±0.370 14.813±2.326**11.785±2.185**組 別Control Cap（200 μmol/L）DHC（200 μmol/L）

圖3 流式細胞儀檢測C6 細胞凋亡

3 討論

神經膠質瘤是發生于神經外胚葉組織的腫瘤，占所有顱內腫瘤的40%～50%[7]。 世界衛生組織將神經膠質瘤依組織學分為：星形細胞腫瘤、少突膠質細胞腫瘤、室管膜腫瘤、脈絡叢腫瘤、混合型神經膠質瘤等。 多生長于額葉、頂葉、小腦丘腦及松果體等部位。 具有高發病率、高復發率、高病死率和低治愈率“三高一低”的特點，所以尋求一種安全良效的抗神經膠質瘤藥物成為當務之急。 本研究證明辣椒素及二氫辣椒素對大鼠神經膠質瘤細胞具有良好的抑制作用，最大抑制率可分別達80.29%、73.92%，能促進C6 細胞凋亡， 且證明其抗腫瘤機制與促進ROS 的產生相關。

骨肉瘤是最常見的惡性成骨性腫瘤之一，多發生于青年男性，其惡性程度極高，治療難度大，預后極差[8]。 絕大部分發現時就已經發生肺部轉移，導致其術后5年生存率低至5%～20%左右[9]。 骨肉瘤的治療進展主要分為兩方面：一是以大劑量化療為主的綜合治療，化療藥物常用環磷酰胺、長春新堿、博萊霉素等；二是保肢手術的開展，明顯降低患者截肢的概率，且對生存率及復發率無明顯影響。 本研究用CCK-8 法證明辣椒素及二氫辣椒素對骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞具有良好抑制作用，最大抑制率可達67.27%、66.14%， 辣椒素及二氫辣椒素有潛力成為骨肉瘤治療的輔助用藥。

細胞凋亡（apoptosis）又名程序性細胞死亡，是機體為維持自身內環境的穩定，在多種基因調控下細胞主動的、嚴密完整的、程序性的死亡過程[10-11]。細胞凋亡的誘導途徑有3 種，分別為：死亡受體途徑（細胞外途徑）、線粒體途徑（細胞內途徑）和內質網途徑。 三種途徑最終匯聚到同一通路，激活caspase-3，損傷腫瘤細胞DNA，最終導致細胞凋亡[12]。ROS 是細胞有氧代謝的產物， 對細胞內的大分子物質具有較大的毒性，能氧化脂質和蛋白質，以及損傷DNA 等[13]。 ROS 還作為體內氧化還原分子的重要一員， 在細胞的增殖、 分化和凋亡過程中發揮重要作用，細胞內ROS 的升高能促進細胞凋亡和壞死[14]，研究表明多種抗腫瘤藥物的機制都與ROS 的產生相關。

綜上所述，辣椒素及二氫辣椒素對大鼠神經膠質瘤C6 細胞、骨肉瘤ROS 17/2.8 細胞具有良好抑制作用，其抑制C6 細胞機制與促進腫瘤細胞凋亡，增加ROS 的產生密切相關，辣椒素及二氫辣椒素有望成為新型抗腫瘤藥物。

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