益母草苷通過誘導自噬減少HeG 2細胞體內的脂質蓄積

張恒 管玲玲 田浩 門秀麗

【摘要】目的：建立高糖培養基誘導的HepG2細胞脂質蓄積模型，探討益母草苷（Ajugol）對脂質代謝的影響及其可能機制。方法：將HepG2細胞分為對照組（BSA組）， BSA + Ajugol，Palmitate，Palmitate + Ajugol四組。通過油紅O染色觀察各組HepG2細胞體內的脂肪含量，Ad-mCherry-GFP-LC3B檢測各組HepG2細胞體內的自噬變化，Western blotting法檢測各組HepG2細胞體內自噬的相關蛋白表達含量。結果：Ajugol實驗組中的LC3蛋白含量增多，并且ajugol實驗組中的脂質有明顯減少。結論：Ajugol能促進自噬減少HepG2細胞體內的脂質蓄積。

【關鍵詞】益母草苷;脂質代謝;自噬;

【中圖分類號】R29 【文獻標識碼】A

基金項目：國家自然科學基金資助課題（81370918）

自噬是真核細胞內的特有功能，它通過自噬體與溶酶體融合行成自噬溶酶體將細胞內破損的細胞器，錯誤折疊的蛋白質和脂質進行降解[1]。近年來，研究發現中藥中的有效成分有減少脂質蓄積的作用，據報道熟地黃有緩解非酒精性脂肪肝的作用，但是目前不知道熟地黃中的成分ajugol是否具有緩解非酒精性脂肪肝的作用[2]。因此，通過建立HepG2細胞高脂模型，觀察ajugol是否對脂肪肝產生預防作用，為臨床防治脂肪肝提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑

人類肝癌細胞HepG2細胞購自American Type Culture Collection公司。BCA蛋白測定試劑盒（中國北京碧云天生物公司），P62抗體（美國Sigma公司），油紅O染色液（中國北京索萊寶科技有限公司）。

1.2主要試劑配制

棕櫚酸酯（Palmitate）配制如下所述，棕櫚酸酯/牛血清白蛋白（BSA）耦合物是將20 mM的palmitate在0.01 M的NaOH孵育30 min以后，然后將5%無脂肪酸的BSA與palmitate以3：1的體積混合，所得到的共軛物含有5 mM的palmitate和3.75%的BSA。使用之前需用DMEM高糖培養基進行稀釋。

1.3 免疫熒光

在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次。用4%的多聚甲醛固定15min接著用1%Triton X-100室溫通透20min接著用PBS浸洗玻片3次，然后用BSA（1%）封閉30min。每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，緊接著加熒光二抗，孵育室溫2h，隨后滴加DAPI避光孵育5min。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 Real-time

將HepG2細胞接種于6孔板中，每孔細胞數約為5×105個。培養24h待細胞貼壁后換成相應的條件培養基收集細胞，按照試劑盒提取細胞總RNA，將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。反應結束后，確認Real-time PCR的擴增曲線和熔解曲線，以2-ΔCt方法計算PPARα，p62和ATG7 mRNA表達水平。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析。各組HepG2細胞中LC3蛋白表達水平以x±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間均數兩兩比較采用t檢驗。以P=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 各組HepG2細胞中油紅O水平

油紅O染色結果顯示， ajugol治療組能較明顯的減少脂質在HepG2細胞上的聚集（P&lt;0.05或P<0.01）。

2.2 各組HepG2細胞在激光共聚焦下的LC3表達水平

與BSA實驗組相比，ajugol實驗組能明顯增強自噬體的數量，此外，palmitate + Ajugol實驗組中的自噬體較Palmitate實驗組的自噬體有所增加，結果表明ajugol能促進自噬（P<0.05或P<0.01）。

2.3 各組HepG2細胞中自噬相關基因的mRNA表達水平

與BSA實驗組比較，ajugol組HepG2細胞中PPARα，p62和ATG7 mRNA表達水平增高（P<0.05）;與BSA + ajugol實驗組相比， palmitate + ajugol實驗組中的PPARα，p62和ATG7 mRNA表達水平升高（P<0.01）。

3 討論

本研究致力于在細胞水平上探討中藥中的有效成分益母草苷對NAFLD的治療作用及其機制。通過HepG2細胞造模， 模擬出NAFLD的細胞模型， 從油紅O染色的結果可以看出， 益母草苷可顯著降低細胞模型中脂滴含量。同時， 通過LC3B的免疫熒光染色檢測發現，改善脂質沉積的機制與自噬有一定的相關性。本實驗對自噬的相關基因P62和ATG7進行檢測，發現益母草苷能較明顯的增強自噬基因的表達，并且益母草苷促進PPARα基因的表達，提示益母草苷能減少脂質在HepG2細胞體內的蓄積。因此，推測益母草苷通過誘導自噬減少脂質在機體內的蓄積。

綜上所述，益母草苷在增強細胞的自噬水平的同時，減少細胞內脂質沉積，說明益母草苷可能通過增強非酒精性脂肪肝細胞的自噬水平降低非酒精性脂肪肝細胞模型脂質沉積生， 因此可能對非酒精性脂肪肝具有一定的治療效果。

參考文獻：

[1]Yoomi， Chun， Joungmok et al. Autophagy： An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life [J]. Cells， 2018.

[2]Zhang R X， Li M X， Jia Z P. Rehmannia glutinosa： review of botany， chemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2008， 117（2）：199-214.