超高效液相色譜

王睿 付志成 胡貽椿 毛德倩 楊曉光 陳競 楊麗琛

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）同時測定血清中維生素A、E的方法。方法：取標準系列工作溶液、空白替代血清樣品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）各50 μL，經硫酸鋅、沉淀劑（甲醇/乙腈=50/50，V/V）沉淀蛋白，振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清，低壓離心揮干，復溶振蕩，12 000 r/min離心5 min，取上清待測。采用Waters BEH Phenyl色譜（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）分離，以0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-甲醇溶液為流動相等度洗脫，電噴霧（ESI）正離子模式、多反應監測模式（MRM）下檢測，內標法定量。結果：UPLC-MS/MS檢測血清維生素A、α-維生素E、β-維生素E線性關系良好，相關系數分別為0.999 3、0.999 3、0.999 7;維生素A、α-維生素E、β-維生素E定量限分別為0.213、0.240、0.070 ng/mL，檢出限分別為0.064、0.072、0.021 ng/mL;維生素A、E在低、高濃度加標回收率范圍分別為89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分別為2.45%～3.43%、1.48%～5.40%。結論：本研究建立的人血清維生素A、E超高效液相色譜-串聯質譜法靈敏度高、準確穩定、重現性好，對血清中維生素 A 和維生素 E 的測定具很好的的應用價值。

關鍵詞：超高效液相色譜-串聯質譜法;維生素A;維生素E;血清

準確評價人體維生素A、E的營養狀況對于相關疾病的及早預防與治療非常重要[1-3]。文獻報道，檢測食品中維生素A、E的方法主要有分光光度法、熒光分析法、高效液相色譜法、雙波電壓法、示波極譜法[4-6]等，國家也分別在2003年、2010年和2016年對食品中維生素A、E的測定出臺及修訂了相關國家標準[7-9]，推薦方法為反相色譜法。人體血液中維生素A、E以多種形式存在，維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類共8種化合物，其中α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強。目前，血清中維生素A、E的測定方法主要有高效液相色譜法、質譜法、酶免疫測定法等[10-13]。人群血清維生素A篩查方法已經建立標準（WS/T 553—2017）[14]。如HIX J[10]等用酶免疫測定視黃醇結合蛋白，但該方法特異性和靈敏度較差，只能測定視黃醇結合蛋白而非視黃醇;高效液相色譜法在同時測定維生素A和維生素E時出峰時間長，分離維生素E的四種異構體時分離度欠佳，對色譜柱及柱溫有較高要求，且樣本量需求較大，一些小的實驗室或大批量人群檢測很難滿足以上條件[11]。賈妍等[12]建立了液相色譜串聯質譜法檢測方法，但該方法僅實現了維生素A和維生素E的定量分析，未完成維生素E四種異構體的定量分析。

本研究目的基于超高效液相色譜-串聯質譜技術（LC-MS/MS法），建立一種分離度好、分離時間短、用血量少的可推廣的血清維生素A、E同時檢測方法，可以準確快速測定維生素A和維生素E異構體含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀、XEVO TQ-S 串聯四級桿質譜儀、Masslynx質譜軟件，均來自美國Waters科技有限公司;電子分析天平（感量0.1mg）;渦旋儀;低速冷凍離心機 KDC-2046，科大創新公司;旋轉真空干燥儀，吉艾姆公司;Milipore純水儀，美國密理博公司;微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 試劑

Retinol-D5同位素標記物（Santa Cruz Biotech公司）：純度>98%或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質;Alpha-Tocopherol-D6同位素標記物（Sigma-Aldrich公司）：純度>98%或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質;維生素A標準品（Retinol）和維生素E標準品（α-Tocopherol、β-Tocopherol、γ-Tocopherol ），均購自Sigma-Aldrich公司;LC/MS級甲醇、LC/MS級甲酸、色譜級乙醇、正己烷、乙腈，均購自Merck公司;牛血清白蛋白（BSA）：純度≥99%;七水合硫酸鋅：純度≥99%;超純水：Milipore純水儀制備。

1.3 試劑配制

沉淀劑：甲醇∶ 乙腈（1∶ 1，v/v）;甲酸-水溶液：0.1%;甲酸-甲醇溶液：0.1%;0.07%BHT甲醇溶液（m/v）;BSA溶液：稱取1.6 g BSA溶解至40 mL水中;Retinol標準儲備溶液（0.5 mg/mL）;α-Tocopherol標準儲備溶液（5 mg/mL）;β-Tocopherol標準儲備溶液（0.5mg/mL）。

1.4 溶液配制

1.4.1 標準溶液配制 取Retinol標準儲備溶液、α-Tocopherol標準儲備溶液、β-Tocopherol標準儲備溶液各100 μL，50% 甲醇-水溶液700 μL配制成混合標準品溶液。工作標準液是將混合標準品溶液逐級稀釋，均用棕色瓶儲存。

1.4.2 內標工作液 Retinol-d5同位素內標標準儲備溶液（1 μg/mL）;α-Tocopherol-d6同位素內標標準儲備溶液（1 μg/mL）;混合同位素內標溶液：1 μg/mL，用50%甲醇-水溶液配制。

1.5 樣品前處理

取標準系列工作溶液各50 μL，在標準系列工作溶液中分別加入混合同位素內標溶液20 μL、空白替代血清樣品（4% BSA牛血清白蛋白溶液）50 μL 、4.5%硫酸鋅水溶液10 μL、200 μL沉淀劑（甲醇/乙腈=50/50，V/V），室溫下渦旋振蕩混勻60 s;加入1 mL正己烷，室溫下渦旋振蕩5 min，然后在4 ℃ 12 000 r/min下離心5 min;吸取0.8 mL上清液至1.5 mL離心管中，低壓離心揮干溶劑;用500 μL初始流動相（0.1%甲酸，96%甲醇水溶液）復溶，渦旋振蕩30 s，繼續4 ℃ 12 000 r/min下離心5 min，上清液轉移至進樣瓶中待UPLC-MS/MS分析。1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件 采用Waters BEH Phenyl色譜柱（柱長100 mm、柱內徑2.1 mm、填料粒徑1.7 μm），以0.1%甲酸-水溶液為流動相A、0.1%甲酸-甲醇溶液為流動相B，按照體積比進行等度洗脫，A相∶ B相=4∶ 96，流速0.3 mL/min，柱溫20 ℃，進樣量2.0 μL。

1.6.2 質譜條件 采用多反應監測模式（MRM）、電噴霧（ESI）正離子模式，噴霧電壓4 000 V，離子源溫度400 ℃，氣簾氣152 psi，霧化器氣流7.0 Bar，去溶劑氣1 000L/Hr（表1、附圖）。

1.7 標準曲線繪制

取混合標準品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐級稀釋（表2），分別加入20 μL混合同位素內標溶液、50 μLBSA溶液、10 μL硫酸鋅溶液、沉淀劑200 μL。由于方法前處理過程較為復雜，為對樣品處理過程中進行質量控制，在樣品處理前加入同位素內標，以校正待測物質在前處理或儀器進樣檢測出現偏差。綜合考慮化合物性質及內標物質的可獲得性，采用性質相似的同類物質作為對應內標，維生素A對應內標物質為Retinol-d5，維生素E對應內標物質為α-Tocopherol-d6。液相色譜和串聯質譜分析條件下，將標準系列工作溶液由低濃度到高濃度進行進樣分析，以維生素A、α-維生素E、β-維生素E的色譜峰與其對應的同位素內標色譜峰的峰面積比值-濃度比值作圖，得到標準系列工作溶液的直線擬合方程，計算其線性相關系數。

2 結果與分析

2.1 液相條件優化

本研究對比了Waters ACQUITY HSS PFP色譜柱、Waters Symmetry C18色譜柱和Waters BEH Phenyl色譜柱，后者獲得了更好地分離效果和比較對稱的峰形，特別是對于維生素E的各種化合物的分離效果很好，也解決了之前其他色譜柱拖尾現象。本研究分別選擇了0.1 %甲酸-水溶液與0.1%甲酸-甲醇溶液分別為95∶ 5、96∶ 4、97∶ 3的比例作為流動相，也對比了不同柱溫（20.30、35℃）、流速（0.2、0.3、0.5 mL/min）和進樣量（1.0、2.0 μL）對加有內標的維生素A、E標準品進行色譜分析，最終選擇峰形最好、保留時間最短的作為此次研究的最終理想色譜條件。

2.2 質譜條件優化

本研究采用多反應監測模式（MRM）、電噴霧（ESI）正離子模式，采用自動調諧優化和手動調諧優化相結合的方式，優化DP、CE、EP和CXP，選定對質譜響應最強的兩個離子對分別作為定量離子對和定性離子對。

2.3 前處理條件優化

本研究采用兩步沉淀蛋白，先使用ZnSO4溶液進行釋放蛋白結合物，然后加入1∶ 1甲醇/乙腈溶液進行沉淀蛋白，結果發現，色譜圖中噪音明顯減少，從而減少雜質對目標峰的影響。

2.4 方法線性范圍、檢出限和定量限

取混合標準品溶液用甲醇-水溶液（1∶ 1，v/v）逐級稀釋（表2）。以色譜峰信噪比S/N=3時對應的濃度作為方法的檢出限，以色譜峰信噪比S/N=10時對應的濃度作為方法的定量限（表3）。

2.5 方法準確度和精密度

取混合血清做本底，加入兩個水平的標準液，每個濃度水平重復6份平行樣，低壓離心揮干后，上機測定，計算其精密度和加標回收率（表4）。

3 討論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定血清中維生素A、E的方法，該方法對前處理的步驟進行了優化，使血清中蛋白沉淀的更加徹底，使色譜圖中噪音明顯減少，從而減少雜質對目標峰的影響，確保了在大批量進樣后色譜圖噪音保存不變。本研究對色譜柱種類進行了考察，最后選擇BEH Phenyl色譜柱，其能最大限度去除雜質分子，擁有更好的分離度和更窄的峰型，使分析物與共流出物更好的分離，以類似物為內標，消除了基質效應的影響。另外，本研究方法相較其他方法前處理需要的樣本量更少，最少取樣量可至20 μL，且維生素A、β-維生素E、α-維生素E保留時間分別為1.29、1.79、1.89 min，3 min可完成1個樣本分析，操作安全簡單，檢測高效快速，尤其適合大批量現場或臨床工作的要求。本研究結果顯示，所測維生素A、E的低、高濃度加標回收率范圍分別為89.7～107.4、97.6～118.1，RSD分別為2.45%～3.43%、1.48%～5.40%，具有較好的準確度和精密度。總之，本方法前處理簡便安全，測定靈敏、準確、重現性好，具有線性范圍寬，檢出限和定量限低的優點，適用于微量血清中維生素 A 和維生素 E 的定量分析研究。◇

參考文獻

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Abstract：Objective ? To establish a method for simultaneous determination of serum vitamin A and E by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）method.Method ? Take 50 μL each of standard series working solution and blank replacement serum sample （4% BSA），after proteins were precipitated by zinc sulfate and precipitant （methanol / acetonitrile = 50/50，V/V），take the supernatant for testing after pre-processing，and then separated by Waters BEH Phenyl （2.1mm×100 mm，1.7 μm）and eluted with the mobile phaes consisted of 0.1% formic acid in water and methanol in a equals program，then analyzed by UPLC-MS/MS with the positive electrospray ionization（ESI+）mode and multiple reaction monitor（MRM）mode，internal standard method for quantification.Result ? UPLC-MS / MS detection of serum vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E had a good linear relationship，the correlation coefficients were 0.999 3，0.999 3 and 0.999 7，respectively.The quantitation limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.213 ng/mL，0.240 ng/mL and 0.070 ng/mL，respectively，the detection limits of vitamin A，α-vitamin E，β-vitamin E were 0.064 ng/mL，0.072 ng/mL and 0.021 ng/mL.Low and high concentration of vitamin A and vitamin E recovery rate were 89.7～107.4 and 97.6～118.1 respectively，RSD were 45%～3.43% and 1.48%～5.40% .Conclusion ? This proposed method is sensitive，accurate and stable，reproducible，and has very good application value for the determination of vitamin A and vitamin E in serum.

Keywords：UPLC-MS/MS;vitamin A;vitamin E;serum