兩種授精方式在高齡低獲卵患者體外受精-胚胎移植中的應用效果比較

黃 瑩 覃愛平

(1 廣西南寧市婦幼保健院生殖醫學中心，南寧市 530011,電子郵箱:xiaoyaodu1986@163.com；2 廣西醫科大學第一附屬醫院生殖醫學研究中心，南寧市 530021)

隨著越來越多的女性推遲生育計劃，以及我國“二孩政策”的全面開放，我國許多高齡婦女有生育要求。《中國高齡不孕女性輔助生殖臨床實踐指南》[1]將≥35歲定為女性生殖高齡。但在高齡女性行超促排卵治療中，常常出現獲卵數少、受精異常的情況[2-4]。2011年歐洲人類生殖及胚胎學會和美國生殖醫學會制定了卵巢低反應(poor ovarian response，POR)的診斷共識——博洛尼亞共識，POR的診斷標準之一是常規促排卵方案獲卵數≤3個[5]。而在2012年由美國生殖醫學協會和輔助生殖技術協會制定的關于非男性因素卵胞漿內單精子顯微注射 (intracytoplasmic sperm injection，ICSI)應用共識[6]中，將獲卵數≤6個歸到“獲卵數少”的范疇。

對于卵母細胞獲得量少的高齡患者，避免胚胎的損失至關重要，因此，選擇最有效的受精方式來增加胚胎成功活產的概率至關重要。早在1998年，就有學者[7]提出，由于ICSI具有高受精率，因此可在高齡低獲卵女性中采用ICSI進行授精，即使這些女性并沒有因為男性因素而不孕。但ICSI的受精過程是將精子注射到卵母細胞胞漿內，規避了自然的選擇，而且作為一種有創性的操作，可能會對卵母細胞造成損傷，所以在高齡、低獲卵、非男性因素不孕的女性中采用ICSI作為授精方式仍存在爭議。本文回顧分析分別行常規體外受精(invitrofertilization,IVF)和ICSI受精的高齡女性患者的臨床資料，比較兩種方法的受精結果、胚胎發育和妊娠情況，探討ICSI能否改善高齡低獲卵患者的助孕結局，旨在為此類患者選擇科學合理的授精方式提供參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月至2018年12月在廣西醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心就診，因輸卵管因素不孕行IVF-胚胎移植(embryo transfer,ET)助孕的150例高齡女性患者，回顧性分析其超促排卵低獲卵周期的資料，按照授精方式分為IVF組101例和ICSI組49例。納入標準：(1)年齡40～45歲；(2)采用黃體期長效長方案超促排卵治療；(3)獲卵數≤5枚；(4)男方體外排精；(5)新鮮胚胎移植(移植D3胚胎)。排除標準：(1)男方嚴重少、弱、畸形精子癥，其中重度少精子癥為3次精液檢查中，兩次精子密度<5×106/mL；重度弱精子癥為3次精液檢查中，兩次前向運動精子比率<10%；重度畸形精子癥，嚴格按精子形態學標準，在3次精液檢查中，兩次正常形態精子<1%,且為原發不育。(2)部分ICSI(half-ICSI)周期。(3)不明原因的前次IVF完全受精失敗或受精率<30%。(4)多囊卵巢綜合征患者。(5)染色體異常。(6)既往卵巢手術史、化療及放療史。(7)子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥。(8)宮腔形態異常、輸卵管積水。

1.2 治療方法 兩組均采用黃體期長效長方案作為控制性超排卵方案。在治療周期的黃體中期(月經規律者：周期第20天或排卵后3～5 d；月經不規則者：口服避孕藥第15天后)，開始應用長效促性腺激素釋放激素注射用醋酸曲普瑞林(達菲林，益普生生物技術公司，3.75 mg/支)肌肉注射,使用劑量根據患者體重個體化決定(1.0～1.5 mg)。促性腺激素(gonadotropins，Gn)啟動需要同時滿足以下幾個條件：(1)降調14 d左右。(2)明確垂體已達到抑制狀態及無妊娠；當日查血性激素促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)<5 IU/L、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)<5 IU/L、雌二醇<50 pg/mL，內膜厚度≤5 mm。Gn常規啟動劑量根據患者的年齡、雙側竇卵泡數目、基礎FSH水平、體表面積及既往治療周期用藥情況綜合決定。卵巢刺激4～5 d后開始用B超監測卵泡發育和雌二醇水平：當卵泡直徑<10 mm，可3～4 d監測1次；當卵泡直徑10～15 mm，可每2～3 d監測1次；當優勢卵泡>15 mm，可每1～2 d監測1次。監測子宮內膜的厚度、形態以及子宮肌瘤等病理征象的變化。期間根據卵泡數量、生長速度和血中的FSH、LH、雌二醇、孕激素水平調整Gn用量。當2～3個主導卵泡直徑達到18 mm，當日抽血查性激素FSH、LH、雌二醇、孕激素水平。使用人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)4 000～10 000 IU或者重組hCG 250 μg進行扳機。一般于注射hCG或重組hCG 34～36 h后取卵。

精液標本采用手淫取精，采用上游法處理新鮮精液樣本。卵母細胞收集后2～6 h內完成受精。IVF組：每個卵周圍放置約2萬～4萬條活動精子；ICSI組：將卵丘復合體去除卵丘細胞核放射冠，檢查卵子的成熟度，使用MⅡ卵進行ICSI操作，精子制動后注入卵細胞，轉入受精培養皿中孵育。IVF后16～20 h，觀察受精情況，受精25～27 h后觀察早卵裂情況，72 h后觀察記錄胚胎分裂情況并進行評分。取卵后第3天移植D3胚胎。從取卵日開始黃體支持(黃體酮注射液肌內注射40～60 mg/d，1次/d)，用至驗孕日。移植后第12～14天查血β-hCG，證實妊娠后繼續應用黃體支持(劑量、用法同上)至胚胎移植后4～6周，行早孕B超。早孕B超證實宮內是否有孕囊、孕囊個數、有無胚芽及心管搏動，是否為異位妊娠。確定宮內妊娠后考慮逐步減量，至妊娠10～12周停止黃體支持。

1.3 胚胎分級標準 IVF后25～27 h觀察并記錄早卵裂情況，IVF后72 h觀察并記錄胚胎分裂情況并進行評分。參考輔助生殖技術協會的胚胎評分系統[8]進行分級：(1)1級，細胞大小均勻，形態規則，透明帶完整，胞質均勻清晰，沒有顆?，F象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的5%；(2)2級，細胞大小略不均勻，形狀略不規則，胞漿折光性輕微改變，可有顆粒現象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的20%但≥5%；(3)3級，細胞大小明顯不均勻，明顯的形狀不規則，可有顆?，F象，或/和碎片所占體積小于卵周間隙的50%但≥20%；(4)4級，細胞大小嚴重不均勻，大量碎片，碎片≥卵周間隙的50%，卵漿色黑。第1天觀察到的正常受精[即出現2個卵原核(2 pronucleus,2PN)]、第3天胚胎的評分達到1、2級，并且胚胎的卵裂球細胞數目≥4個，評為可移植胚胎；第3天胚胎的評分為1、2級，并且胚胎的卵裂球細胞數目≥6個，評為優質胚胎。

1.4 觀察指標 (1)一般資料：女方年齡、男方年齡、女方體質指數、不孕類型、不孕年限。(2)治療相關臨床資料：基礎FSH、竇卵泡、Gn使用天數及用量，hCG日血清LH、雌二醇、孕酮，男方精液相關檢查(取卵日精子濃度、精子前向運動百分率)，以及獲卵數、2PN數、2PN卵裂胚胎數、可移植胚胎數、優質胚胎數、移植胚胎數。(3)受精和胚胎情況、妊娠結局：正常受精率、D3優胚率、著床率、臨床妊娠率、早期流產率、活產率。計算方法[9]：IVF正常受精率=D1出現2PN卵子數/IVF加精卵子總數×100%，ICSI正常受精率=D1出現2PN卵子數/注射MⅡ卵子總數×100%；D3優胚率=D3優質胚胎數/正常受精卵裂胚胎數×100%；著床率=孕囊數/移植胚胎數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；早期流產率=孕12周內自然流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=活產的分娩數/移植周期數×100%。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的計量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料以例數(百分數)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者一般資料及治療相關臨床資料比較 兩組的女方年齡及體質指數、男方年齡、不孕類型、不孕年限差異無統計學意義(均P>0.05)，治療相關臨床資料差異無統計學意義(均P>0.05)，提示兩組患者具有可比性，見表1～2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 兩組患者治療相關臨床資料比較

組別n精液濃度(x±s,百萬/mL)精子前向運動百分率(x±s,%)獲卵數(x±s,個)2PN數(x±s,個)2PN卵裂胚胎(x±s,個)可用胚胎數(x±s,個)優質胚胎數[M(P25,P75),個]移植胚胎數(x±s,個)IVF組101109.78±50.7548.08±14.153.21±1.372.37±1.172.27±1.162.19±1.101(0,2)1.88±0.73ICSI組49104.99±63.7143.69±15.633.51±1.282.35±1.202.35±1.202.22±1.161(0,2)1.92±0.76 t/z值0.4981.719-1.2930.094-0.391-0.186-0.426-0.290P值0.6190.088 0.1980.925 0.697 0.852 0.670 0.772

2.2 兩組患者受精、胚胎情況和妊娠結局比較 兩組患者在正常受精率、優胚率、著床率、臨床妊娠率、早期流產率和活產率差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

表3 兩組患者受精、胚胎情況和妊娠結局比較

3 討 論

ICSI選擇已經排出第一極體的MⅡ期卵母細胞進行操作，但是第一極體排出代表卵母細胞核已經成熟，并不代表細胞質的成熟。細胞質和細胞核均成熟的卵母細胞才有受精能力[10]，所以ICSI選擇的MⅡ期卵母細胞并不全是細胞核和細胞質都成熟，可能存在細胞核和細胞質成熟的不同步。而在常規IVF中，直到授精后16～18 h才檢查卵母細胞的成熟度，卵丘細胞復合體在培養中保持完整，允許更多的卵母細胞完成成熟并隨后受精。由此可見，由于人為挑選出來的MⅡ期卵母細胞可能存在細胞核和細胞質成熟的不同步，因此常規IVF中的卵母細胞的自然成熟度可能優勝于ICSI的MⅡ期卵母細胞。

近年有大量的回顧性研究比較了常規IVF和ICSI兩種受精方式對子代出生缺陷和子代發育、健康狀況的影響，但所得結論不盡相同，仍存在爭議[11-12]。多數的觀點認為，與常規IVF相比，因嚴重男性因素不孕行ICSI助孕夫婦的子代的泌尿生殖系統出生缺陷更高，而因非嚴重男性因素不孕行ICSI助孕夫婦的子代出生缺陷則無顯著差異[13-19]。目前針對子代發育、健康狀況的研究還存在不足，因隨訪年限較短，無法精確判斷ICSI安全性。同時ICSI的醫療費用更高，加重了不孕患者的經濟負擔，使得不孕患者再進行治療的依從性下降。本研究中，常規IVF組和ICSI組的一般資料及治療相關臨床資料差異均無統計學意義(均P>0.05)，說明兩組具有可比性；在此基礎上，兩組的正常受精率、早期流產率、優胚率、著床率、臨床妊娠率、活產率差異并無統計學意義(均P>0.05)，這與既往研究[20-21]結果相似。說明ICSI與常規IVF臨床效果相當。

胚胎學家們在進行ICSI時會選擇形態正常的活動精子，但因為不能確定新鮮活動精子上有無碎裂或變性的DNA，所以不能避免選到異常精子的風險；此外，ICSI繞過了受精過程的大部分步驟，質量差的卵母細胞可以通過ICSI獲得正常受精，這可能導致臨床妊娠不成功或妊娠后出現早期流產。另一方面，常規IVF是一個精卵自由選擇的偏向自然的過程，而ICSI是侵入性的機械操作，精卵被動結合，如果ICSI操作時損傷了赤道板，使分裂中期的細胞受損，或者是一些難以覺察的細小損傷，它們的發育潛力都有可能會迅速下降。這也許可以解釋在本研究中，盡管ICSI組的正常受精率較IVF組稍高，但仍然無法獲得更好的優胚率、著床率和活產率的原因。

綜上所述，從有效利用有限的卵母細胞、改善助孕結局的出發點來說，高齡、低獲卵數、非男性因素不孕的患者應用ICSI并不比常規IVF更具有優勢。