不同硬化劑治療后兔血管內皮及其周圍組織病理變化*

劉翔宇，魏 志，孫自勤

1.山東省濟寧市第一人民醫院消化內科(濟寧272000)；2.山東省立醫院西院區消化內科(濟南 250031)；3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六零醫院消化內科(濟南 250031)

食管胃靜脈曲張(Gastroesophageal varices，GOV)約見于50%肝硬化患者，是肝硬化門脈高壓癥的常見并發癥之一[1-2]。食管胃靜脈曲張破裂出血(Esophagogastric variceal bleeding，EVB)患者病死率高，是消化系統的急危重癥之一[3-4]。目前內鏡下治療食管胃靜脈曲張的方法主要有內鏡下硬化劑注射治療和內鏡下曲張靜脈套扎術。常用于GOV治療的硬化劑為聚桂醇注射液[4-5]。近年來，泡沫硬化劑也逐漸得到了大家的重視，目前在下肢靜脈曲張、血管畸形的治療中已廣泛應用[6-7]，但是在GOV的治療中應用較少。本研究通過觀察不同硬化劑、不同注射方式以及不同時點下實驗動物血管壁及其周圍組織病理變化情況，為臨床選擇硬化劑、治療方式提供理論依據。

材料與方法

1 實驗動物 普通級新西蘭大白兔86只，2月齡，雌雄不限，體質量2～2.5 kg，按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

2 實驗試劑 聚桂醇注射液(國藥準字H20080445)和血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)鼠單克隆抗體等。

3 實驗方法

3.1 動物分組：取兔耳緣靜脈171支，分為聚桂醇組(81支)、泡沫硬化劑組(81支)和生理鹽水組(9支)。①聚桂醇組：又分為血管內注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管內注射，不壓迫血管)、血管旁注射(27支，聚桂醇注射液0.1 ml血管旁皮下多點注射)和聯合注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管內注射，0.1 ml血管旁皮下多點注射)。②泡沫硬化劑組：將聚桂醇注射液與空氣按1∶4比例混合制備泡沫硬化劑[8-11]。注射方式以及劑量同聚桂醇組。③生理鹽水組：生理鹽水0.2～0.3 ml血管內注射，不壓迫血管。

3.2 標本制作及觀察分析：分別于注射后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、120 h、168 h取兔耳緣靜脈及血管周圍組織作為標本。所有標本均固定、包埋，進行HE染色和免疫組化染色。對蠟塊連續切片各5張，在高倍鏡(10×40倍)下隨機選取5個非重合的視野進行觀察，棕黃色或黃色為陽性細胞。采用Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析系統進行VEGF光密度分析，取平均值。

結 果

1 聚桂醇組注射后的組織病理學變化

1.1 HE染色：注射聚桂醇注射液3 h后，兔耳緣靜脈均出現血管內皮細胞增生、排列紊亂，伴少量炎細胞浸潤。24 h后，內皮細胞破壞，血管周圍組織細胞出現輕度水腫，聯合組較其他兩組更明顯。72 h后，出現血小板聚集伴明顯炎細胞浸潤。120 h后，血小板呈網格狀聚集，內充紅細胞，血栓開始機化。168 h后，血管壁及血管周圍纖維化，血栓機化，聯合組出現更早。見圖1。

1.2 免疫組化染色：VEGF平均光密度在不同注射方式下均表現為先上升后下降，其上升峰值出現在注射后72 h。聯合注射上升更明顯，血管旁注射次之。相同注射方式下各時段間比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時段不同注射方式間比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時段不同注射方式間兩兩比較，血管內注射與血管旁注射、聯合注射相比，差異具有統計學意義(P<0.05)；血管旁注射與聯合注射相比，差異無統計學意義(P=0.095)。見表1(圖2)。

表1 聚桂醇組各時段VEGF平均光密度

2 泡沫硬化劑組注射后的組織病理學變化

2.1 HE染色：病理變化與聚桂醇組基本一致，但炎癥反應較聚桂醇組輕微(圖3)。

2.2 免疫組化染色：VEGF平均光密度變化趨勢與聚桂醇組基本相似，峰值也出現在注射后72 h。聯合注射上升趨勢更明顯，血管旁注射次之。相同注射方式下各時段比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時段不同注射方式間比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。同時段不同注射方式間兩兩比較，血管內注射與血管旁注射、聯合注射相比，差異具有統計學意義(P<0.05)；血管旁注射與聯合注射相比，差異無統計學意義(P=0.095)。見表2(圖4)。

3 生理鹽水組注射后的組織病理學變化 HE染色下，鏡下未發現血管壁損傷及血栓形成。免疫組化染色下，VEGF平均光密度各時段比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 泡沫硬化劑組各時段VEGF平均光密度

4 相同注射方式下不同硬化劑組間VEGF平均光密度兩兩比較

4.1 血管內注射：聚桂醇組分別與泡沫硬化劑組和生理鹽水組比較，泡沫硬化劑組與生理鹽水組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

4.2 血管旁注射：聚桂醇組與泡沫硬化劑組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

4.3 聯合注射：聚桂醇組與泡沫硬化劑組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。

討 論

自Cassaigness于1853年首先提出硬化劑療法以來，采用硬化劑治療靜脈曲張已有150多年的歷史。泡沫硬化劑的概念在1944年由Orbach最先提出。目前在下肢靜脈曲張的治療中，多已采用泡沫硬化劑。有研究[12]表明，泡沫硬化劑與液體硬化劑相比效果更好，但副作用沒有明顯增加。

為了解不同注射方式及不同硬化劑注射后血管內皮細胞的變化及血管周圍的微血管增生情況，本研究選擇VEGF的表達進行研究，對HE染色及免疫組化結果綜合分析。結果發現注射聚桂醇注射液后VEGF的表達表現為先上升后下降，注射后72 h表達最高；各時段之間比較，差異有統計學意義。不同注射方式間比較，聯合注射上升最快，VEGF表達最高，下降較緩慢，血管旁注射次之，血管內注射最低。各注射方式間比較，VEGF表達差異有統計學意義；兩兩比較時，血管內注射VEGF表達與血管旁注射、聯合注射比較，差異均有統計學意義，但血管旁注射和聯合注射比較無統計學差異。

有文獻[13-14]報道，聚桂醇注射液以黏膜下注射為主，因為靜脈旁注射引起周圍組織水腫及炎癥的作用迅速，并促進成纖維母細胞的增生，而黏膜下注射基本不破壞血管內皮，且不易形成血栓。同時，在本研究中血管旁注射和聯合注射中均發現血管周圍大量成纖維細胞增生。張春榮等[15]在SD大鼠氣管黏膜下注射1%乙氧硬化醇0.05 ml后，分別于第1、3、5、7天行VEGF免疫組化染色及電鏡觀察，結果發現黏膜下層VEGF的表達增加，其表達在第3～5天達到最高峰，且電鏡下觀察發現第3天開始細胞周圍的膠原纖維較以往增多，第5天膠原纖維增生明顯且排列整齊，第7天膠原纖維排列致密，本研究中VEGF表達的變化過程與其相一致。

與液體硬化劑相比，泡沫硬化劑具有其獨特的優點[16-18]：首先，泡沫使其與血管內膜的接觸面積增大，在相同劑量下可以達到更好的效果；其次，泡沫硬化劑易于分布在血管內皮表面，可使其與血管的接觸時間延長；最后，泡沫硬化治療可以在超聲引導下進行。本研究發現，泡沫硬化劑注射后血管病理變化與聚桂醇注射液基本一致，但是血管內損傷、炎癥情況都較聚桂醇注射液輕微。因此，雖然兩種硬化劑均具有血管損傷輕、硬化止血效果好、組織修復快等優點，都可以供臨床選擇。但泡沫硬化劑的血管損傷更輕微，周圍組織恢復更快，應作為首選的硬化劑。

在注射方式的選擇方面，楊培生等[19]在研究大鼠的股靜脈在不同硬化劑注射后的病理變化時發現，血管內注射和黏膜下層注射聯合應用時可以發揮其相互協同的作用：①可以減少注入血管的硬化劑的量；②血管旁注射后血管受到擠壓，可以使血管壓力下降。本研究中，聯合注射在組織學和VEGF平均光密度的趨勢上明顯優于血管內注射及血管旁注射，故聯合注射可作為首選的注射方法。

綜上所述，聚桂醇及其制備的泡沫硬化劑都是理想的硬化劑。與聚桂醇注射液相比，泡沫硬化劑具有血栓形成快、組織損傷小、組織修復快等優點。在注射方式上血管內聯合血管旁注射更具有優勢。