心肌組織、耳緣靜脈給予養心通脈方劑含藥血清內皮祖細胞混懸液的AMI兔心功能觀察

朱智德，盧健棋，龐延，溫志浩，梁逸強，韓景波，彭志林，林浩

1廣西中醫藥大學，南寧 530023；2廣西中醫藥大學第一附屬醫院

急性心肌梗死(AMI)是一種冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起心肌壞死的急危病癥，及時進行犯罪血管血運重建是治療本病重要手段。盡管目前經皮冠狀動脈介入治療(PCI)得到廣泛開展，但術后仍有半數患者存在心肌微循環灌注甚至無復流等不良事件，嚴重影響心功能恢復，這與血管內皮細胞受損及血管微循環障礙密切相關[1～3]。內皮祖細胞(EPCs)能夠通過旁分泌機制調節血管修復和生成改善微循環，并且能夠保護和補充受損內皮細胞有效改善心功能，EPCs移植在改善AMI預后具有潛在的應用前景[4]。養心通脈方劑是我院全國名老中醫李錫光主任治療冠心病有效經驗方，我們前期研究證實以10%濃度養心通脈方劑含藥血清干預96 h能夠顯著增強EPCs增殖、遷移、黏附能力[5]。本研究將養心通脈方劑含藥血清EPCs移植到AMI兔體內，觀察其對AMI兔血管新生密度及心功能影響，以期為中醫藥聯合干細胞移植治療AMI提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性家兔39只，12周齡，體質量2.0～2.2 kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 養心通脈方劑(紅參、麥冬、五味子、當歸、川芎、白術、桂枝、炙甘草、黃芪、白芍、丹參、木香、檀香)購于廣西中醫藥大學第一附屬醫院，以傳統工藝煎煮濃縮，最終生藥濃度為1.66 g/mL。兔骨髓淋巴細胞分離液(天津灝洋公司，批號：2013LRA)，PBS緩沖液(維森特公司，批號：311-010-CL)，人纖維連接蛋白(HFN，美國Roche，批號：1105140700)，胎牛血清(FBS，Hyclone，批號:SV30087.01)，EPCs專用培養基(EGM-2，Lonza，批號：CC-3202)，胰酶(Hy Clone，批號：SH30042.01B)，戊巴比妥鈉(Serve，批號：201505)，CCK-8試劑盒(日本同仁公司，批號：EJ875)，全波長酶標儀(ThermoFisher，型號：1510)，小動物呼吸機(CKENT SCIENTIFIC ORPORATION公司，型號：RSP-1002)，EGC-6511型心電圖機(上海光電醫用電子儀器廠)，便攜式彩色超聲診斷儀(SonoSite，型號：WK2M17)。

1.3 養心通脈方劑含藥血清、EPCs及混懸液制備 ①養心通脈方劑含藥血清制備：取兔1只，灌胃給予8 mL/(kg·d)養心通脈方劑，劑量參照《藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算》[6]，2次/d，連續5 d，末次給藥后半小時于兔頸總動脈無菌取血，離心并分離血清，56 ℃水浴30 min滅活，-20 ℃保存備用。②EPCs制備[5,7]：另取兔3只，耳緣靜脈麻醉后從股骨干抽取骨髓組織，密度梯度離心法獲取單個核細胞(MNC) ，并逐步離心洗滌MNC，將 MNC以含10% FBS的EGM-2培養基懸起并調整細胞密度，再接種到預先用HFN(5 μg/cm2)包被的25 cm3培養瓶中培養。培養48 h后首次半量換液，以后3 d換全液1次以淘汰不貼壁細胞，將原代貼壁細胞經體外誘導分化培養16 d后，通過EPCs特異性標志物(CD34)對EPCs進行鑒定后，培養到第20天的EPCs用無血清培養基培養24 h使細胞同步化，消化重懸并調整細胞密度至5×105/mL。③養心通脈方劑含藥血清EPCs混懸液制備：將10%養心通脈方劑含藥血清置入含10%FBS的EGM-2培養基培培養96 h，制作成養心通脈方劑含藥血清EPCs培養液[5]。

1.4 實驗動物分組、AMI模型制備及養心通脈方劑EPCs混懸液移植方法 35只雄性SPF級兔隨機分為7組各5只。A、B、C、D、E組均參照文獻[8]方法(結扎冠狀動脈)制備AMI模型；A、B組制模15 min后，再次打開胸腔，每點吸取混懸液250 μL(A組給予養心通脈方劑EPCs混縣液，B組給予EPCs，均為8×105/mL)分別于結扎區附近心肌組織分5點注射，關閉胸腔；C、D組制模后即刻經耳緣靜脈注射混懸液1 mL(C組給予養心通脈方劑EPCs混縣液，D組給予EPCs，均為1×107/mL)；E組僅制模，不干預;移植后連續注射青霉素3 d預防感染。F組只開胸穿線，不結扎左冠狀動脈前降支，耳緣靜脈注射1 mL生理鹽水。G組不作處理。

1.5 兔心臟彩超相關指標檢測 各組于制模后2周進行心臟彩超檢測。實驗動物麻醉后取平臥位，剪去胸前區毛，涂耦合劑，采用二維超聲心動圖，選用9 MHz高頻矩陣探頭進行檢測，檢測指標包括左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVDs)、射血分數(EF)，切面選取及超聲測量依據美國超聲心動圖學會制定的標準，取5個心動周期的平均值。

1.6 兔梗死心肌區和缺血心肌區CD34陽性反應強度觀察及血管新生密度計算 術后14 d處死各組動物，取出心臟，用冰冷生理鹽水沖洗干凈，取梗死心肌區、缺血心肌區組織切片并制作石蠟切片保存，取切片常規脫蠟后，采用Envision法行CD34免疫組化染色，用圖像分析系統進行定量分析，染色呈棕黃色為陽性，陽性反應強度=陽性反應面積/平均光密度。在低倍鏡下選擇CD34標記的新生血管高密度區域，100倍鏡下計數3個視野，取平均值，管腔大于8個紅細胞直徑的血管不計在內，計算心肌組織不同區域新生血管密度。

2 結果

2.1 各組LVDs、LVDd、EF比較 LVDs、LVDd、EF比較見表1。

表1 各組LVDs、LVDd、EF比較

2.2 各組梗死心肌區和缺血心肌區CD34陽性反應強度、血管新生密度比較 梗死心肌區和缺血心肌區CD34陽性反應強度、血管新生密度比較見表2。

表2 各組梗死心肌區和缺血心肌區CD34陽性反應強度、血管新生密度比較

3 討論

AMI常常引起心肌缺血、缺氧，導致心肌內皮細胞凋亡，并誘導血管內皮腫脹和微血管痙攣，甚至引起毛細血管阻塞，當缺血時間>20 min后，內皮細胞開始快速腫脹變形，引起冠脈微血管縮舒反應能力喪失，心外膜血流恢復減緩或微循環血流阻斷，導致心肌損傷心功能嚴重下降[9]。因此，阻止損傷心肌內皮細胞凋亡、補充促進內皮細胞生成分化和促進心肌血管再生改善心肌灌注是PCI術等治療手段以外重要的輔助治療策略。EPCs是來源于人體骨髓、外周血管的內皮細胞前體細胞，研究發現體外培養的人體外周血EPCs根據培養時限不同其作用機制也不同，其早期(1周)培養的EPCs主要通過表達促血管生成因子如VEGF、趨化因子3/4/18、細胞趨化因子12/16和募集、促進循環系統中成熟內皮細胞增殖發揮血管新生作用，而晚期(2～4周)培養的EPCs主要通過增殖分化成內皮細胞直接發揮改善心功能作用[10]。此外相關研究證實，EPCs不管是經心內膜注射移植或經冠狀動脈移植均能夠明顯促進新生血管生成而改善心功能和減少心肌梗死面積作用，并且能夠有效減輕冠心病心絞痛和心衰癥狀以及具備一定預防PCI術后支架再狹窄能力[11～13]。EPCs移植具有巨大研究潛力，但如何發揮移植EPCs治療AMI最大效能目前仍是一個重大挑戰。

中醫藥防治冠心病已有多年的研究歷史，《素問·痹論》曰:“心痹者，脈不通”，明確指出血瘀致心脈閉塞不通。《景岳全書》曰：“氣血虛寒，不能營養心脾者，最多心腹痛證”，說明氣血虛弱，不能濡養心脈而發心痛。《醫林改錯》曰：“元氣既虛，必不能達于血管，血氣無力，并停留于瘀”，提出氣虛不能推動血液運行，氣血運行不暢，血脈凝滯，不通則痛，而發心痛，說明氣虛血瘀是冠心病的重要病理基礎。養心通脈方劑是全國名老中醫李錫光主任治療冠心病經驗方，此方寓通于補，通補兼施，是標本兼治的有效驗方，方中人參有大補元氣，為君藥；黃芪、白術甘溫，助人參以補肺健脾，白芍、麥冬、五味子、炙甘草酸甘化陰，養陰斂肺，助人參以益心復脈，同為輔藥；當歸、丹參、川芎養血活血，祛瘀通脈，檀香、木香、桂枝芳香溫通、行氣活血，同為佐使藥。諸藥配伍，具有益氣養陰、活血祛瘀、養心通脈之功效，在臨床上取得了良好的療效，具有促血管生成，保護血管內皮功能以及改善心功能作用[14～16]。本研究顯示，養心通脈方劑含藥血清EPCs移植治療AMI具有促進梗死心肌區及缺血心肌區血管新生作用，有效改善AMI后心功能，提示中醫藥聯合干細胞移植治療AMI具有一定優勢；同時研究結果亦提示，耳緣靜脈注射與心肌注射移植療效上并無明顯差異。

總之，養心通脈方劑含藥血清EPCs可能通過促進血管新生進而改善心功能，耳緣靜脈注射與心肌注射效果相似。