ox-LDL誘導的Raw264.7細胞炎癥因子表達變化及PPARγSer273磷酸化調控作用觀察

沈娜，方濤，蘇衛東，劉勇，李煥明

天津市第四中心醫院，天津 300140

動脈粥樣硬化(AS)是一種脂質異常觸發的動脈內膜慢性炎癥性疾病，巨噬細胞所介導的炎癥反應在AS的發生發展中發揮關鍵作用。既往研究[1,2]表明，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可誘導巨噬細胞發生炎癥，細胞中TNF-α、IL-1β等促炎因子呈高表達。研究[3,4]顯示，PPARγ對心血管疾病具有一定的保護作用，具有減輕氧化應激、抑制炎癥反應、改善糖脂代謝、拮抗細胞凋亡等功能，與AS的發生發展呈負相關。此外還有研究發現，PPARγ磷酸化對AS也具有調節作用，CDK5介導的PPARγSer273磷酸化可調節多種與AS相關的脂肪因子的釋放，如脂聯素、瘦素、抵抗素、內脂素等[5～8]，間接促進了AS發生發展，拮抗了PPARγ的抗AS作用。然而，PPARγSer273磷酸化對AS的直接作用仍不明確。2018年9月～2019年12月，我們觀察了ox-LDL誘導后小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株Raw264.7中炎癥因子表達變化和PPARγSer273磷酸化情況，探討PPARγSer273磷酸化是否通過促進ox-LDL誘導的巨噬細胞炎癥反應起到促進AS的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 Raw264.7細胞(中國科學院上海細胞庫)，293T細胞(南開大學分子病毒學實驗室惠贈)。DMEM培養基(美國Gibco公司)，標準胎牛血清(美國Hyclone公司)，EDTA-胰蛋白酶消化液(北京Solarbio公司)，氧化低密度脂蛋白(廣州奕元生物技術有限公司)，pPPARγ(美國New England Peptide公司)，PPARγ、β-actin(美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG(北京Solarbio公司)，TNF-α酶聯免疫吸附試劑盒(美國R&D Systems公司)，IL-1β酶聯免疫吸附試劑盒(加拿大Anogen-Yes Biotech公司)，LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Thermofisher公司)，總RNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)，cDNA合成試劑盒(日本Takara公司)，qPCR試劑盒(美國Promega公司)，引物(上海生工生物工程股份有限公司)。CO2培養箱、生物安全柜(美國Thermo Fisher公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，PCR儀(瑞士Roche公司)，酶標儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 ox-LDL誘導后Raw264.7細胞炎癥因子和PPARγSer273磷酸化檢測 ①Raw264.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β分泌量檢測：取對數期生長的Raw264.7細胞，以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養基(90%DMEM培養基+10%標準胎牛血清)，于37 ℃、5%CO2的環境的培養箱中培養。待細胞融合至70%左右進行分組，將實驗分為ox-LDL組和對照組，ox-LDL組加入50 mg/L的ox-LDL誘導，對照組則不予任何處理，24 h后，采用ELISA法檢測細胞培養液中炎癥因子TNF-α和IL-1β的濃度。收集上述兩組細胞的培養液，置于EP管中，以3 000 r/min速度離心5 min，分別按照TNF-α和IL-1β試劑盒說明書進行操作，每個樣品設置2個復孔。于酶標儀450 nm處讀取各孔吸光度值，以標準品吸光度值為橫坐標，濃度為縱坐標繪制標準曲線，計算各孔樣品濃度值(pg/mL)，每組重復3次，取平均值。②Raw264.7細胞中PPARγSer273磷酸化水平檢測：Raw264.7細胞培養、分組和干預方法同“①”。采用Western blot法檢測PPARγ和PPARγSer273磷酸化蛋白的相對表達量。將各組細胞收集至1.5 mL的EP管中，使用含1%PMSF的RIPA裂解液，于搖床上4 ℃裂解30 min，裂解結束后，離心吸取上清，即為細胞總蛋白。以BCA法測定各組蛋白濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液。樣品蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜上，將PVDF膜置于10%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，一抗(兔抗pPPARγ、PPARγ均為1∶1 000，鼠抗β-actin為1∶10 000)室溫孵育3 h，HRP偶聯的二抗(1∶10 000)室溫孵育45 min，ECL法顯色后于凝膠成像儀中成像，以β-actin作為內參，使用Image Lab軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，計算PPARγSer273磷酸化與PPARγ蛋白相對表達量的比值，作為PPARγSer273磷酸化水平，每組重復3次，取平均值。

1.3 PPARγSer273位點突變后Raw264.7細胞炎癥因子分泌量、mRNA檢測 ①構建并篩選PPARγ缺陷型Raw264.7細胞：a.使用293T細胞構建逆轉錄病毒顆粒。取對數期生長的293T細胞，以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞融合至60%時進行分組，實驗分為實驗組和無關對照組，實驗組取水泡型口炎病毒G蛋白包膜蛋白質粒、莫羅尼白血病病毒包裝質粒和PPARγ缺陷型重組質粒稀釋至1 μg/μL，以1∶2∶2的比例與lipo2000混勻共轉染293T細胞，48 h后收集上清，以12 000 r/min速度離心20 min獲得PPARγ缺陷型病毒顆粒；無關對照組重組質粒為無關對照質粒，其余處理方式同實驗組。b.用上述病毒顆粒感染Raw264.7細胞。取對數期生長的Raw264.7細胞，以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞融合至70%時進行分組，實驗分為實驗組、無關對照組和未處理組。實驗組取出1 mL培養基后，加入含PPARγ缺陷型病毒顆粒的培養基(500 μL病毒顆粒+1 μL polybrene+499 μL DMEM完全培養基)，以3 000 r/min離心10 min提高感染效率。24 h后，加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選出穩定表達PPARγ缺陷型細胞系；無關對照組加入含無關對照的病毒顆粒，其他處理方法同實驗組；未處理組不予任何處理。c.觀察PPARγ沉默情況。取“①b”中的3組細胞，利用“1.2”中的方法提取蛋白并檢測PPARγ蛋白的相對表達量，與無關對照組和未處理組比較，實驗組未檢出PPARγ表達，表明PPARγ沉默成功。②構建并篩選PPARγSer273突變型和PPARγ野生型Raw264.7細胞：a.制備PPARγSer273突變型和PPARγ野生型病毒顆粒，方法同“①a”。b.用上述病毒顆粒感染PPARγ缺陷型Raw264.7細胞。取對數期生長的PPARγ缺陷型Raw264.7細胞，以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞融合至70%時進行分組，S273A+ox-LDL組細胞經PPARγSer273突變型質粒轉染，并以50 mg/L ox-LDL誘導；S273A組細胞經PPARγSer273突變型質粒轉染，但不予50 mg/L ox-LDL誘導；WT+ox-LDL組經PPARγ野生型質粒轉染，并以50 mg/L ox-LDL誘導；WT組組經PPARγ野生型質粒轉染，但不予50 mg/L ox-LDL誘導；其余處理方式同“①b”。c.觀察PPARγSer273突變型和PPARγ野生型Raw264.7細胞構建情況。取上述“②b”中的S273A組和WT組細胞，利用“1.2”中的方法進行蛋白提取并檢測各組細胞PPARγ和PPARγSer273磷酸化蛋白的相對表達量，兩組PPARγ蛋白相對表達量無差異，而與WT組相比，S273A組不再檢測出磷酸化，說明細胞系構建成功。③PPARγSer273位點突變后Raw264.7細胞炎癥因子分泌量檢測：取對數期生長的PPARγSer273突變型和PPARγ野生型Raw264.7細胞，分別以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，待細胞融合至70%左右進行分組，實驗分為S273A+ox-LDL組、S273A組、WT+ox-LDL組、WT組。S273A+ox-LDL組和WT+ox-LDL組分別加入50 mg/L的ox-LDL誘導，S273A組和WT組不予任何處理，24h后，采用ELISA法檢測各組細胞培養液中炎癥因子TNF-α和IL-1β的濃度，方法同“1.2”。④PPARγSer273位點突變后Raw264.7細胞中TNF-α、IL-1β mRNA檢測：細胞培養、分組和干預方法同“③”。采用PCR法檢測各組細胞中TNF-α和IL-1β的mRNA的相對表達量，首先使用RNeasy Mini Kit提取各組細胞總RNA，隨后用PrimeScript RT-PCR Kit將其反轉錄為cDNA。引物：TNF-α：上游5′-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3′，下游5′-GTGGTTTGCTACGACGTGGG-3′，IL-1β：上游5′-ATGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′，下游5′-TGATGTGCTGCTGCGAGATT-3′。按照Promega GoTaq qPCR Master Mix試劑盒說明書進行目的基因擴增，反應體系：RNase Free Water 7.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，GoTaq qPCR Master Mix 10 μL，模板cDNA 2 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min，循環反應設置為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，50個循環。反應結束后，得出各組樣品的Ct值，以β-actin為內參，利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，每組重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 ox-LDL誘導后Raw264.7細胞TNF-α、IL-1β分泌量、PPARγSer273磷酸化水平比較 ox-LDL誘導后Raw264.7細胞TNF-α、IL-1β分泌量、PPARγSer273磷酸化水平比較見表1。

表1 ox-LDL誘導后Raw264.7細胞TNF-α、IL-1β分泌量、PPARγSer273磷酸化水平比較

2.2 PPARγSer273位點突變后Raw264.7細胞TNF-α、IL-1β分泌量、mRNA表達水平比較 PPARγSer273位點突變后Raw264.7細胞TNF-α、IL-1β分泌量、mRNA表達水平比較見表2。

表2 PPARγSer273位點突變后Raw264.7巨噬細胞TNF-α、IL-1β分泌量和mRNA比較

3 討論

心血管疾病是威脅人類健康的主要疾病，隨著生活水平的迅速提高和生活方式的巨大改變，心血管疾病的發病率和死亡率顯著上升[9]，AS是多種心血管疾病的病理基礎，巨噬細胞作為AS核心細胞，在AS整個疾病過程中都發揮重要作用，包括單核巨噬細胞募集、巨噬細胞泡沫化、巨噬細胞增殖、凋亡、極化、壞死等，這些功能的綜合作用決定了疾病的進展與消退。小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株Raw264.7是一種常見的AS模型細胞，在泡沫細胞形成、炎癥反應、氧化應激、巨噬細胞遷移等方面均有研究[10～12]。此外，Raw264.7細胞易于培養，轉染效率高，因此本研究選擇此細胞作為研究對象，進行后續實驗。

TNF-α和IL-1β是AS相關炎癥因子,AS患者外周血中TNF-α、IL-1β均呈高水平狀態[13]。研究[14]顯示，TNF-α可通過增加LDL跨內皮細胞的轉運使其在血管壁滯留，促進AS的發生。Yuan等[15]也指出TNF-α加速了巨噬細胞向泡沫細胞的轉化，誘導AS脂紋形成。IL-1β也被證明具有促AS的作用，一項大型雙盲研究中指出IL-1β抗體卡那奴單抗可通過降低IL-1β活性改善心肌梗死患者的預后，并降低炎癥標志物水平[16]，細胞和動物實驗均證實，靶向IL-1β抗體能夠抑制AS炎癥因子的分泌，減小病變面積[17]。因此，針對于TNF-α和IL-1β的機制研究越來越受到關注。ox-LDL是一種誘發斑塊炎癥的標志物[18]，一方面其通過啟動TLRs信號通路使巨噬細胞產生TNF-α[19],另一方面通過激活炎癥小體NLRP3，產生IL-1β[20]。炎癥反應可受多種潛在機制的調節，PPARγ作為AS的保護因子，其抗炎作用早已得到證實，研究顯示PPARγ通過調節TNF-α、IL-1、IL-6、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)等因子改善內皮功能，從而發揮抗AS的作用[21]。Yao等[22]研究指出，PPARγ可誘導巨噬細胞分化為M2抗炎表型，從而改善了細胞炎癥狀態，起到抑制斑塊形成，維持斑塊穩定性的作用。PPARγ的作用受翻譯后修飾的調節，如磷酸化、乙酰化、泛素化等，不同的生物學修飾可發揮不同功能，其中PPARγSer273磷酸化主要參與肥胖相關胰島素抵抗相關機制，本課題組前期研究證實，PPARγ部分激動劑替米沙坦通過降低PPARγSer273磷酸化來改變脂聯素、瘦素、FABP4、GLUT4和CAP的表達，促進脂聯素分泌，從而增加胰島素敏感性[23]。另有研究表明脂肪細胞中的PPARγSer273磷酸化可誘導TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達[24]，因此我們推測在巨噬細胞中，PPARγSer273磷酸化也可能具有相同作用。本研究發現，ox-LDL刺激后，PPARγSer273磷酸化水平增加，同時炎癥因子釋放增加，提示PPARγSer273磷酸化可能促進了巨噬細胞炎癥反應。為進一步驗證其作用，我們將PPARγSer273位點進行突變，并以WT型PPARγ作為對照，檢測細胞中炎癥因子分泌和表達水平，結果顯示PPARγSer273位點突變后該位點不再檢測出磷酸化水平，且隨著磷酸化水平的消失，兩種促炎因子的分泌和表達水平也下降，驗證了PPARγSer273磷酸化對巨噬細胞炎癥因子的促進作用。

總之，PPARγSer273磷酸化促進了ox-LDL誘導的巨噬細胞炎癥反應，進一步加速了AS進程。