1,25(OH)2D3對高糖誘導的人腎小球系膜細胞株增殖能力、周期分布影響及其機制

王麗媛，唐小鐵，戚婷，于洋，崔學彬，徐潔

1武漢科技大學醫學院，武漢 430000；2武漢科技大學附屬普仁醫院

文獻[1]報道，我國慢性腎臟病(CKD)患病率較高，腎小球濾過率<60 mL/(min·1.73 m2)的人群中糖尿病(DM)患者占19.1%，蛋白尿人群中DM患者占17.3%[2]，DM已經成為CKD的首要病因。糖尿病腎病(DN)作為DM最常見的微血管并發癥之一，患病人數占DM總數的20%～40%[3]。研究[4]表明，DN、系膜增生性腎小球腎炎等多種CKD均能導致系膜細胞(Mc)過度增殖、系膜外基質大量沉積、腎臟正常生理結構破壞，最終發展為腎小球硬化(GS)、腎功能衰竭。當前DM患者基數巨大，DN發病率高，然而對于DN的治療方式單一，以控制血糖血脂血壓等高危因素、避免腎毒性食物藥物、延緩腎功能惡化為主，尚缺乏特異性治療藥物。腎小球系膜細胞是腎小球最主要的固有細胞之一，對維護腎小球毛細血管床結構完整性、維持系膜基質代謝平衡、保護腎臟正常免疫功能有重要的作用。腎小球系膜細胞的過度增殖可導致腎臟系膜區增生、系膜外基質異常積蓄，這幾乎是所有CKD存在的病理特性，同樣也是DN發病的中心環節。因此，設法調控腎小球系膜細胞的增殖活性，有助于改善腎臟病理損傷、延緩DN的發生及演變[5]。1,25二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]是最具生物活性的維生素D，不僅具有調節鈣磷代謝作用，還具有調節機體免疫、抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、誘導細胞分化等多種生物學效應[6]。2017年12月～2018年6月，我們觀察了1,25(OH)2D3對高糖誘導的人腎小球系膜細胞株增殖能力、周期分布影響，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 人腎小球系膜細胞株(上海拜力生物人腎小球系膜細胞供應商)。磷酸鹽緩沖液(PBS)，低糖DMEM粉劑，無支原體胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，碘化丙啶，1,25(OH)2D3，D-葡萄糖,甘露醇，LY294002，CCK-8試劑盒，兔抗人mTOR單克隆抗體，小鼠抗人p-mTOR單克隆抗體，山羊抗小鼠二抗，兔抗人Akt單克隆抗體，山羊抗兔二抗，兔抗人p-Akt單克隆抗體。

1.2 人腎小球系膜細胞培養 復蘇后的人腎小球系膜細胞接種于盛有低糖DMEM完全培養液的無菌培養瓶中，細胞在瓶內呈貼壁生長。將培養瓶置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度環境下，當細胞生長至70%～80%融合時放棄原有培養液，先用PBS工作液輕柔地洗滌2次，再添加0.25%胰蛋白酶消化傳代，之后將培養瓶放置在37 ℃、5%CO2、飽和濕度環境下繼續培養，取第3～8代用于實驗。向生長良好的對數期人腎小球系膜細胞中添加0.25%的胰蛋白酶進行消化處理。處理完成后統計數目并接種于培養板中，待觀察到細胞全部貼壁后，放棄原有培養基，加入無血清DMEM進行同步化處理24 h。

1.3 1,25(OH)2D3干預后人腎小球系膜細胞增殖抑制率測算 采用CCK-8試劑盒。取生長良好的對數期人腎小球系膜細胞，以1×104個/mL接種于96孔板內，200 μL/孔，培養至細胞貼壁后，用無血清DMEM同步化24 h。按照實驗設計將細胞分為6組，干預組加入30 mmol/L的D-葡萄糖和10-8mol/L的1,25(OH)2D3，1,25(OH)2D3組加入10-8mol/L的1,25(OH)2D3[7]，高糖組加入30 mmol/L的D-葡萄糖[8]，高滲組加入25 mmol/L的甘露醇，LY294002組加入2 μg/mL的LY294002，正常對照組未加任何刺激物，各組繼續培養48 h。各組結束干預前4 h每孔分別加入10 μL的CCK-8溶液，繼續培養4 h，用酶標儀測定各孔在450 nm波長處的吸光度值(A450)，以上實驗重復3次，每次均設置無細胞組作為空白調零組，實驗結束后計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

1.4 1,25(OH)2D3干預后人腎小球系膜細胞周期分布觀察 采用流式細胞術。取生長良好的對數期人腎小球系膜細胞，以2×105個/mL接種于6孔板內，2 mL/孔，培養至細胞貼壁后，無血清DMEM同步化24 h，實驗分組及干預同“1.3”，各組繼續培養48 h，48 h后收集細胞，用預先凍存的70%冰乙醇重懸細胞，吹打混勻，-20 ℃固定過夜。過夜后離心去除乙醇，PBS洗滌一遍，再用PBS重懸細胞，加入RNAseA(終濃度10 μg/ μL)及碘化丙啶染液(終濃度50 μg/ mL)，37 ℃避光保存40 min，上機檢測。以上實驗重復3次，每次試驗每個實驗組均設置4個復孔。測得數據按以下公式計算系膜細胞增殖指數，系膜細胞增殖指數=S期和G2/M期細胞比例之和/(G1期、S期和G2/M期細胞比例之和)。

1.5 1,25(OH)2D3干預后人腎小球系膜細胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白檢測 實驗分組及干預同“1.3”將各組細胞裂解后，高速離心25 min，后取上清，按BCA試劑盒說明書進行配平，加入合適比例的Loading Buffer后煮沸8 min使蛋白質變性，依次經過上樣電泳，PVDF轉模，5%奶粉封閉，PVDF置于一抗孵育，TBST洗滌6×5 min，二抗室溫孵育2 h，滴加ECL發光試劑，X線片曝光，沖洗和掃描后，采用Gelpro軟件比較各組條帶的相對灰度值即可表示蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞A450及增殖抑制率比較 細胞A450及增殖抑制率見表1。

表1 各組細胞A450及增殖抑制率比較

2.2 各組細胞G1期、S期、G2/M期個數及Mc細胞增殖指數比較 各組細胞G1期、S期、G2/M期個數及Mc細胞增殖指數比較見表2。

表2 各組G1期、S期、G2/M期占比及Mc細胞增殖指數比較

2.3 各組細胞Ap-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比值比較 各組細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相對表達量比值比較見表3。

表3 各組細胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比較

3 討論

腎小球系膜細胞是腎小球最主要的固有細胞之一，對于腎臟的正常生理活動具有重要意義。研究[9]證實，腎小球系膜細胞的增殖及層黏蛋白、Ⅳ型膠原在系膜基質的集聚是DN的病理性特征。體外細胞實驗發現，暴露于高糖環境中會使腎小球系膜細胞加速增殖，并大量分泌各種細胞因子、膠原蛋白及其他細胞外基質。動物實驗發現，STZ誘導構建的DN小鼠模型尿白蛋白排泄水平較正常組明顯升高，而且模型組小鼠腎臟病檢提示腎臟的系膜區擴大、纖連蛋白表達增多[10]。臨床觀察也證實，5～7年病程的DM患者行腎臟病檢即能發現腎小球Mc增殖和腎小球肥大[11]。大量研究均證實，高糖可促進人腎小球系膜細胞的增殖，刺激多種促生長、促增殖的細胞內信號因子產生增多，誘導氧化應激反應，導致系膜細胞的過度增殖、系膜外基質的病理集聚，最終使腎小球正常結構被破壞，致腎功能衰竭。因此采取干預措施抑制高糖對腎小球系膜的促增殖作用，對于保護腎臟功能，延緩DN的進展具有至關重要的作用。

1,25(OH)2D3是生物活性最強的維生素D，通過遍布全身各處的VitD受體施展生物效應。除了被大眾熟知的調節鈣磷代謝的作用外，目前1,25(OH)2D3在免疫調節、細胞增殖分化、抗腫瘤、抗衰老等眾多領域也被廣泛應用。1,25(OH)2D3可通過Runx2的過表達促進成骨細胞向脂肪細胞的轉分化[12]；通過下調Toll樣受體4介導的炎癥通路減輕DM大鼠肝臟損傷[13]；通過PI3K/Akt/mTOR通路對神經起保護作用[14]。一項為期3年納入530例T2DM患者的前瞻性研究結果提示，合并VitD缺乏的T2DM患者DN發生率明顯高于VitD含量正常的T2DM患者，且這一結果相對獨立，不受高血壓、高脂血癥、吸煙、ACEI/ARB類藥物使用史等外圍因素的干擾。范樂平等[15]發現，T2DM人群體內血清活性VitD含量隨尿蛋白程度的上升而下降，與血肌酐、尿素氮等反映腎功能的指標呈負相關。多項研究已經證實，VitD缺乏是DN的獨立危險因素，其在從DM、到DN、ESRD的疾病演變過程中發揮重要作用，因此足量的1,25(OH)2D3具有腎臟保護效應。動物實驗發現，1,25(OH)2D3作用于5/6腎切除動物模型，可抑制腎小球細胞增生，延緩GS[16]；作用于DN大鼠模型，可降低尿白蛋白排泄，抑制腎小球系膜增殖[17]。胡婧等[18]發現，給予骨化三醇治療組尿蛋白排泄率、24 h尿蛋白量、血肌酐、白介素-6水平均低于安慰劑組，提示骨化三醇有助于DN患者減輕蛋白尿、緩解炎性反應狀態。本研究顯示，1,25(OH)2D3能夠有效對抗高糖介導的腎小球系膜細胞增殖。

文獻[19]報道，PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白質合成的主要信號調節通路。各種生長因子、胰島素受體及外界刺激等作用可使PI3K激活，活化的PI3K生成PIP3進一步激活AKT，PIP3含有與AKT相同的PH結構域，兩者相互識別并結合，將AKT由胞漿轉位至胞膜，同時使AKT的構象發生變化，進而AKT被磷酸化，活化的AKT直接激活mTORC1或通過TSC1/2復合物進一步激活其下游分子MtorC1，從而實現對細胞增殖的調控[20]。Rane等[21]發現，PI3K/Akt/mTOR通路參與了高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡。邢玲玲等[22]認為，高糖可能通過激活該通路誘導足細胞分泌Ⅳ型膠原。實驗證實，高糖可活化PI3K、誘導mTOR上調，促進系膜細胞的肥大增殖[23]。本文結果顯示，給予高糖處理后p-Akt、p-mTOR的表達明顯增多，系膜細胞增殖加速。臨床研究[24～26]表明，利拉魯肽可上調PI3K/Akt通路改善高糖誘導的內皮細胞凋亡，番茄紅素能通過PI3K/Akt通路改善高糖誘導的足細胞損傷，非洛貝特、烏索酸通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化而抑制高糖誘導的系膜細胞增殖，雷帕霉素可明顯抑制高糖誘導的系膜細胞增殖。本研究顯示，與高糖組比較，1,25(OH)2D3干預組p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR相對表達量比值降低，表明1,25(OH)2D3對抗高糖介導的系膜細胞增殖的作用可能與下調PI3K/Akt/mTOR信號通路相關。

總之，1,25(OH)2D3可抑制高糖誘導的人腎小球系膜細胞的增殖活化，并將細胞阻滯于G1/S期，作用機制可能與其可下調PI3K/Akt/mTOR通路的表達有關。