miR-32-5p和FKBP14基因轉(zhuǎn)染對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其靶向關(guān)系驗(yàn)證

楊丹芬，謝圓媛，姜棚菲，白娟，林芳

延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西延安 716000

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率和病死率[1]。肺癌根據(jù)組織學(xué)特性分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC占80%以上[2]。由于NSCLC細(xì)胞增殖、遷移較快，多數(shù)患者在就診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)最佳的手術(shù)治療時(shí)間，5年生存率較低[3]。從分子水平探究發(fā)展病因，對(duì)NSCLC的靶向分子治療具有重要作用。近年研究顯示，微小RNA-32-5p(miR-32-5p)參與調(diào)控胰腺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4～6]。孫昱等[7]發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中miR-32呈低表達(dá)，其可作為NSCLC診斷的分子標(biāo)志物。目前，miR-32-5p對(duì)NSCLC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制尚不清楚。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白14(FKBP14)的3′非編碼區(qū)(3′UTR)存在與miR-32-5p相結(jié)合的位點(diǎn)，提示miR-32-5p調(diào)控FKBP14表達(dá)。研究[8,9]顯示，F(xiàn)KBP14在骨肉瘤、胃癌等腫瘤中發(fā)揮重要作用，但其對(duì)NSCLC的影響也還未知。2019年2～10月，本研究觀察了miR-32-5p和FKBP14基因轉(zhuǎn)染對(duì)人NSCLC細(xì)胞系SPC-A1增殖、遷移、侵襲能力的影響，并驗(yàn)證其靶向關(guān)系，以期為NSCLC的靶向分子治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染物及主要試劑 NSCLC細(xì)胞系SPC-A1、A549、H460和正常肺上皮細(xì)胞系EBAS-2B來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。miR-32-5p模擬物(mimics)、模擬對(duì)照物、miR-32-5p抑制劑、抑制劑對(duì)照物、FKBP14過(guò)表達(dá)載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，PCR引物序列購(gòu)自上海生工生物工程公司，兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1、MMP-2、MMP-9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，F(xiàn)KBP14抗體購(gòu)自以色列ProSpec-Tany公司，LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 NSCLC細(xì)胞系的選擇 取SPC-A1、A549、H460、EBAS-2B細(xì)胞，均加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2、濕度97%的培養(yǎng)箱中。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入適量磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后，0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將各細(xì)胞調(diào)整濃度為0.5×103個(gè)/mL，以每孔1.0 mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-32-5p、FKBP14 mRNA，Western blotting法檢測(cè)FKBP14蛋白。SPC-A1、A549、H460、EBAS-2B細(xì)胞miR-32-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.04、0.30±0.03、0.38±0.05、1.00±0.10，F(xiàn)KBP14 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.01±0.20、1.88±0.18、2.25±0.22、1.00±0.10，F(xiàn)KBP14蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.90±0.09、0.88±0.08、0.75±0.07、0.25±0.03，SPC-A1、A549、H460細(xì)胞分別與EBAS-2B細(xì)胞比較，P均<0.05。SPC-A1細(xì)胞與EBAS-2B細(xì)胞比較差異最為顯著，根據(jù)以上結(jié)果，選擇SPC-A1細(xì)胞作為本研究的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.3 轉(zhuǎn)染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1細(xì)胞存活率測(cè)算 采用MTT法。SPC-A1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con，分別記為A、B、C、D、E、F組。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，在培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。然后調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×103個(gè)/mL，以每孔0.2 mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，充分溶解結(jié)晶紫，振蕩混勻后，于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.4 轉(zhuǎn)染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。SPC-A1細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法和分組同“1.3”。收集各組細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為5×104個(gè)/mL。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μL細(xì)胞懸液，加入Transwell上室。下室加入500 μL含10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：先將Matrigel基質(zhì)膠用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋(1∶8)，鋪于Transwell上室，自然晾干后，加入100 μL細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5 轉(zhuǎn)染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。SPC-A1細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法和分組同“1.3”。收集各組細(xì)胞，使用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量，按照30 μg/每泳道蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后，將其置于5%脫脂奶粉中進(jìn)行封閉，時(shí)間1 h。分別置于CyclinD1(1∶800)、MMP-2(1∶1 000)和MMP-9(1∶1 000)一抗孵育液中，4 ℃孵育過(guò)夜。置于山羊抗兔二抗(1∶3 000)孵育液中，室溫孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目前蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 miR-32-5p與FKBP14靶向關(guān)系、調(diào)控作用驗(yàn)證 ①靶向關(guān)系：PCR擴(kuò)增含miR-32-5p結(jié)合位點(diǎn)的FKBP14的3′UTR序列，構(gòu)建FKBP14野生型質(zhì)粒(FKBP14-WT)和突變型質(zhì)粒(FKBP14-MUT)。SPC-A1細(xì)胞分為G、H、I、J組，參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染FKBP14-WT+miR-con、FKBP14-WT+miR-32-5p、FKBP14-MUT+miR-con、FKBP14-MUT+miR-32-5p。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)熒光素酶活性，以熒光蟲(chóng)熒光/海腎熒光的比值表示各組的熒光素酶活性。②調(diào)控作用：采用Western blotting法。SPC-A1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為K、L、M、N組。參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-32-5p、miR-con、anti-miR-32-5p、anti-miR-con。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基，在培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中FKBP14蛋白表達(dá)，具體操作步驟同“1.5”，其中FKBP14抗體稀釋度1∶1 000。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.2 各組細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 各組細(xì)胞熒光素酶活性及FKBP14蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 G、H組細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.00±0.12、0.42±0.04，兩組比較P<0.05；I、J組細(xì)胞熒光素酶活性分別為1.05±0.16、1.02±0.11，兩組比較P>0.05。K、L組FKBP14蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.04、0.90±0.11，M、N組KBP14蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.32±0.12、0.92±0.10，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

NSCLC是常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病，具有較高的發(fā)病率和致死率[10]。目前，NSCLC的治療手段主要有手術(shù)切術(shù)、放療和化療等。近年來(lái)，隨著治療手段和技術(shù)的提高，NSCLC的治療有了較大提高，但由于NSCLC發(fā)病隱匿，早期缺乏典型特征[11]。臨床資料顯示，多數(shù)NSCLC患者在確診時(shí)已處于中晚期，癌細(xì)胞已浸潤(rùn)周圍正常組織，錯(cuò)過(guò)最佳手術(shù)治療時(shí)間[12]。目前，NSCLC的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此探討影響NSCLC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，并尋找用于其治療的分子靶點(diǎn)具有重要意義。

miRNA是一類長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，其可在轉(zhuǎn)錄后水平與靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[13]。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p通過(guò)直接與孤核受體TR4 mRNA的3′UTR結(jié)合抑制TR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲。郭明等[15]認(rèn)為，miR-32-5p通過(guò)靶向作用于果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2的3′UTR的特異序列，抑制EZH2基因的表達(dá)，降低口腔癌CAL-27細(xì)胞的增殖能力。Liu等[16]的研究顯示，上調(diào)miR-32-5p表達(dá)可通過(guò)抑制同源盒B8表達(dá)減弱宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，克隆形成及侵襲、遷移能力。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)KBP14是miR-32-5p的靶基因。FKBP14屬于FK506結(jié)合蛋白家族成員，因其基因突變?cè)谌祟愔袝?huì)導(dǎo)致一種特殊類型結(jié)締組織病而受到廣泛關(guān)注。隨著對(duì)FKBP14研究的深入，發(fā)現(xiàn)其也參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[17]顯示，胃癌組織和細(xì)胞系中FKBP14表達(dá)升高，敲減FKBP14表達(dá)顯著抑制胃癌MKN-45和AGS細(xì)胞的增殖、黏附和侵襲能力。miR-361通過(guò)靶向下調(diào)FKBP14表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞系的侵襲和增殖，可作為骨肉瘤治療的潛在作用靶點(diǎn)[18]。目前，F(xiàn)KBP14對(duì)NSCLC的影響還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-32-5p或敲減FKBP14后，SPC-A1細(xì)胞的存活率、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-32-5p或敲減FKBP14均可抑制SPC-A1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示miR-32-5p、FKBP14參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，二者可能是NSCLC靶向治療的新靶點(diǎn)。

CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞增殖[19]。研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-149可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中CyclinD1的表達(dá)，抑制SW480增殖[20]。基質(zhì)金屬蛋白酶是一類可水解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的酶類，參與調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲。目前，對(duì)MMP-2和MMP-9在腫瘤中的研究最為廣泛，其表達(dá)增加可通過(guò)水解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[21]。研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-142-3p可通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)降低NSCLC細(xì)胞株的遷移和侵襲能力[22]。本研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-32-5p或敲減FKBP14均可明顯降低SPC-A1細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-32-5p或敲減FKBP14抑制了SPC-A1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-32-5p可與FKBP14的3′UTR靶向結(jié)合，且miR-32-5p過(guò)表達(dá)后，SPC-A1細(xì)胞中FKBP14蛋白表達(dá)降低，而敲減miR-32-5p過(guò)表達(dá)后，F(xiàn)KBP14蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步證實(shí)了miR-32-5p靶向負(fù)調(diào)控FKBP14表達(dá)。此外，過(guò)表達(dá)FKBP14逆轉(zhuǎn)了miR-32-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，且過(guò)表達(dá)FKBP14逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)miR-32-5p對(duì)SPC-A1細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)的抑制作用，說(shuō)明miR-32-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向抑制FKBP14來(lái)降低SPC-A1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

總之，過(guò)表達(dá)miR-32-5p可降低NSCLC細(xì)胞系SPC-A1的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制與下調(diào)FKBP14表達(dá)有關(guān)，此為NSCLC的靶向分子治療提供了新靶點(diǎn)。