轉化生長因子β相關激酶1抑制劑對人肝癌細胞系HepG2脂滴積累的影響及其機制

王坤，陳奧，馬石楠,3

1湖北醫藥學院，湖北十堰 442000；2武漢科技大學；3十堰市太和醫院

肝臟是脂質代謝的重要場所，如果代謝出現問題會導致肝內脂肪細胞堆積。脂肪肝是一種慢性肝臟疾病，以脂滴在肝細胞中的異常累積為特征，可發展為脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化，甚至演變為肝癌。轉化生長因子β相關激酶1(TAK1)是一種蛋白激酶，除在炎癥免疫反應中發揮重要作用[1]，也參與細胞增殖、分化、生存的調控[2]。有研究[3]指出，在小鼠脂肪細胞中特異敲除TAK1可以有效減少肥胖的發生。TAK1在脂質細胞代謝方面發揮重要作用，然而其具體調控機制尚不清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是PPAR亞型，抑制PPARγ可以減輕由飲食所誘導的肥胖和糖尿病[4]，PPARγ在脂肪肝以及肝臟變性中發揮重要作用。研究[5～7]顯示，誘導細胞凋亡DNA分裂因子樣效應因子C(CIDEC)在促進甘油三酯積累、調控脂滴融合、抑制甘油三酯分解方面發揮重要作用。文獻[8]報道，敲減TAK1能夠減少3T3L-1前脂肪細胞的脂肪分化，而PPARγ是脂肪細胞分化過程的關鍵轉錄因子。因此，在HepG2細胞脂滴積累的過程中，TAK1很可能通過PPARγ影響肝細胞的脂滴積累。TAK1抑制劑(NG25)是一種合成的Ⅱ型TAK1抑制劑，可有效抑制TAK1活性[9～11]。靶向TAK1作為一種提高腫瘤治療效果的策略，已經在幾種惡性腫瘤中進行了研究，但目前關于NG25對脂滴積累的作用以及其對肝癌潛在治療作用鮮有報道。2018年10月～2019年11月，我們觀察了NG25對人肝癌細胞系HepG2脂滴積累的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 HepG2細胞、人胚腎細胞系HEK-293T購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。PPARγ、GAPDH、CIDEC抗體購自美國Abcam公司，NG25 trihydrochloride購自美國Sigma公司。

1.2 NG25處理的HepG2細胞油紅O染色紅光強度觀察 取HepG2細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養在37 ℃、5%CO2環境中。將細胞分為處理組和對照組，處理組細胞加入2 μmol/L NG25處理24 h，對照組加入等體積DMSO處理24 h，兩組均同時用終濃度為250 μmol/L脂肪酸(OA、PA各125 μmol/L)共同孵育。采用油紅O染色檢測細胞內脂滴積累情況：0.5 g干粉溶解到100 mL異丙醇中，37 ℃溫育溶解配制成油紅O原液，油紅O原液與ddH2O以3∶2混合，混合過濾染液靜置10 min后。細胞用預冷的PBS洗3次，每次5 min，再使用4%多聚甲酸固定30 min，隨后用混合過濾染液染色10～15 min，PBS洗3次之后可進行DAPI復染后明膠固定，最后用預冷PBS洗3次并進行封片。顯微鏡下進行觀察采圖，圖像用Image J軟件分析，以單位面積內的紅色光強度表示細胞內脂質積累。

1.3 NG25處理的HepG2細胞PPARγ mRNA、蛋白及PPARγ啟動子轉錄活性檢測 細胞培養、分組和干預方法同“1.2”。①PPARγ mRNA：取對數期生長的的HepG2細胞，吸去培養基，24孔板每孔加入600 μL的TRIzol試劑，室溫靜置5 min，轉移至離心管中，加入0.2倍體積的氯仿(4 ℃預冷)，用力振搖15 s，靜置5 min，4 ℃環境下以12 000 r/min速度離心15 min，轉移上清至新離心管中，加入等體積的異丙醇(4 ℃預冷)，顛倒混勻，靜置10 min，4 ℃環境下以12 000 r/min速度離心15 min，棄上清，沉淀用500 μL的75%乙醇(4 ℃預冷)清洗，4 ℃環境下以8 000 r/min的速度離心5 min，棄上清，沉淀自然晾干，用適量DEPC水溶解，-80 ℃保存，用M-MLV逆轉錄酶和T18將提取的RNA反轉錄成cDNA。采用AlleleID 7軟件與Primer Premier 5軟件設計定量PCR引物，分別為GAPDH正向引物5′-TGGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′，反向引物5′-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3′，PPARγ正向引物5′-CATTCTGGCCCACCAACTTTGG-3′，反向引物5′-TGGAGATGCAGGCTCCACTTTG-3′。定量PCR引物，cDNA模板和SYBR Green mix(Takara)共同配制20 μL反應體系在CFX96定量儀器(Bio-Rad)中進行擴增，反應結束后，得出各組樣品的Ct值，以GAPDH為內參，利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，每組重復3次，取平均值。②PPARγ蛋白：貼壁的HepG2細胞收取蛋白樣品時，棄去培養基，PBS清洗1次，加入1 mL蛋白裂解液，冰浴15 min，4 ℃環境下以12 000 g/min的速度離心15 min后取上清備用。用BCA法測定蛋白濃度，并將蛋白濃度調整一致后再與含有溴酚藍的上樣緩沖液充分混合后在100 ℃沸水中煮5 min使蛋白變性。按薩姆布魯克方法配制8%分離膠和5%濃縮膠。在電泳裝置加入適量SDS電泳緩沖液，在加樣孔中加入處理好的蛋白樣品，每孔上樣20 μL。接通電源，電壓調至80 V，待溴酚藍指示劑跑到分離膠底部時斷電，結束電泳。取SDS-PAGE電泳后的凝膠，用轉印裝置將蛋白帶轉印到PVDF膜上，在低溫環境下，100 V電壓轉膜1 h。將膜置于5%的BSA封閉液中封閉8 h，棄去封閉液后，用TBST洗滌3次，每次5 min，加入適當稀釋的一抗溶液，4 ℃孵育超過8 h，棄去一抗，TBST洗滌3次，每次5 min，加入適當稀釋的二抗溶液，37 ℃孵育1 h，棄去二抗，TBST洗滌3次，每次5 min。加入配制好的化學發光液滴于膜上，待充分反應后，用成像系統采圖，用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。③PPARγ啟動子熒光素酶活性：取HEK-293T細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養于37 ℃、5%CO2環境中。將PPARγ的啟動子(2200/ 1)片段構建到pGL3-Basic質粒上，將HEK-293T細胞接種于24孔板中培養，每孔加入500 μL細胞生長培養基，待細胞密度達到80%～90%時，進行細胞轉染：將1 μg 該重組質粒與1 μL脂質體分別溶于50 μL Opti-DMEM培養基中，混勻后室溫靜置5 min；將脂質體與質粒輕柔吹打混勻，總體積為100 μL，室溫靜置20 min；將孔板中細胞用DMEM無血清培養基清洗，然后加入100 μL質粒—脂質體復合物，并加入400 μL的Opti-DMEM培養基，培養于37 ℃、5%CO2環境下；轉染6 h后，更換成細胞生長培養基。將實驗分為2組，分組和干預方法同“1.2”。熒光素酶活性檢測：HEK-293T細胞棄去培養基，用1×PBS清洗細胞，24孔板的每孔加入80 μL的1×Passive Lysis Buffer，用細胞刮鏟刮下細胞，冰上靜置30 min。收集樣品至1.5 mL離心管中，以3 000 r/min速度離心5 min，轉移上清至新離心管中。配制Luciferase Assay BufferⅡ與Stop&Glo試劑，避光放置。取10 μL細胞裂解樣品置于新離心管中，加入40 μL Luciferase Assay BufferⅡ，輕柔混勻，放入熒光光度計中，反應時間為5 s，檢測熒光素酶活性，記錄數據，該數據為螢火蟲熒光素酶的活性；將離心管取出，加入40 μL Stop&Glo試劑，輕柔混勻，放入熒光光度計中，反應時間為5 s，檢測熒光素酶活性，記錄數據，該數據為海腎熒光素酶的活性。將測得的螢火蟲熒光素酶的活性值與相應的海腎熒光素酶的活性值的比值作為熒光素酶的相對表達活力。

1.4 NG25處理的HepG2細胞CIDEC mRNA、蛋白檢測 HepG2細胞培養、分組和干預方法同“1.2”。CIDEC mRNA檢測方法同“1.3中的①”，CIDEC正向引物5′-GCAAGCTGCTCAGGAATAAAG-3′，反向引物5′-GCTGGAGGGCTCAAAATGGT-3′。CIDEC蛋白檢測方法同“1.3中的②”。

1.5 超表達PPARγ的HepG2細胞CIDEC mRNA、蛋白檢測 HepG2細胞培養同“1.2”。實驗共分為3組。恢復組：HepG2細胞預先轉染1 μg質粒PPARγ后再加入2 μmol/L NG25處理24 h，轉染步驟見“1.3中的③”；處理組：HepG2細胞加入2 μmol/L NG25處理24 h；對照組：HepG2細胞加入等體積DMSO處理24 h。3組均同時用終濃度250 μmol/L脂肪酸(OA、PA各125 μmol/L)共同孵育。CIDEC mRNA相對表達量的檢測方法同“1.3中的①”，CIDEC蛋白相對表達量的檢測方法同“1.3中的②”。

2 結果

2.1 處理組和對照組油紅O染色紅光強度比較 處理組及對照組油紅O染色紅光強度分別為154±10、202±12，兩組比較，P<0.05。

2.2 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達量及PPARγ啟動子熒光素酶活性比較 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達量及PPARγ啟動子熒光素酶活性比較見表1。

表1 處理組和對照組PPARγ mRNA、蛋白相對表達量及PPARγ啟動子熒光素酶活性比較

2.3 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達量比較 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達量比較見表2。

表2 處理組和對照組CIDEC mRNA、蛋白相對表達量比較

2.4 恢復組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達量比較 恢復組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達量比見表3。

表3 恢復組、處理組、對照組CIDEC mRNA和蛋白相對表達量比較

3 討論

脂滴是細胞內中性脂的主要貯存場所，脂滴異常積累引起會肥胖、脂肪肝、心血管疾病、糖尿病、中性脂貯存性疾病等諸多代謝病變，而非酒精性脂肪肝是其中最為常見的一種。目前，非酒精性脂肪肝的治療手段主要是控制飲食，控制體質量和增加運動。非酒精性脂肪肝病開始于肝臟甘油三酯的過度積累，而且非酒精性脂肪肝病患者肝臟通過募集并活化巨噬細胞分泌IL1β、IL18、IL12、TNF-α和CCL2、CCL5等炎癥因子，導致肝臟炎癥和纖維化的發生，從而進一步促進肝癌的形成[12]。研究顯示，TAK1在脂肪肝和脂肪肝炎的發展中發揮著重要作用。文獻[13]報道，E3連接酶TRIM8可以通過引起TAK1的泛素化，進而促進TAK1的磷酸化，從而促進由高脂飲食誘導產生的脂肪肝以及脂肪肝炎。TAK1的激活可以顯著的促進非酒精性脂肪肝的發生和發展[14]。基于以上研究成果，我們推測通過抑制TAK1的活性可以抑制脂滴的積累，從而起到阻遏肝病的作用。

NG25是一種新型的TAK1抑制劑，可以有效抑制TAK1活性。研究[15,16]表明，NG25可作為乳腺癌、結腸癌等惡性腫瘤的潛在治療策略，但關于NG25對脂滴積累和對肝癌等相關疾病的治療效果的作用還沒有相關報道。本研究為了探索NG25對HepG2細胞中脂滴積累的影響，我們將處理組和對照組細胞用油紅O進行染色，并在顯微鏡下觀察，結果顯示NG25能夠顯著降低細胞中的脂滴積累，提示NG25對HepG2細胞脂滴積累有抑制作用。

據報道，肥胖小鼠PPARγ表達量顯著上調[17]，而ob/ob小鼠中特異的抑制PPARγ的表達可以改善脂肪肝[18]。CIDEC定位于脂滴表面，其能夠通過促進單室大脂滴形成增加脂滴積累[19]。為了研究NG25在HepG2細胞中是否通過PPARγ和CIDEC來影響肝細胞的脂滴積累，我們檢測了細胞PPARγ和CIDEC mRNA、蛋白，結果顯示與對照組相比，處理組細胞PPARγ和CIDEC mRNA、蛋白相對表達量均下調，且通過抑制TAK1的活性能夠降低PPARγ啟動子的轉錄活性。有研究表明，在3T3L-1細胞中PPARγ能夠作為一個轉錄因子促進CIDEC啟動子的轉錄，而我們前期數據顯示抑制TAK1活性能同時下調PPARγ和CIDEC的表達，我們推測在HepG2細胞中TAK1抑制劑可能通過PPARγ調控CIDEC的表達。為進一步驗證這一推測，我們收集3組細胞RNA和蛋白進行檢測，結果顯示超表達PPARγ能夠有效的逆轉由NG25處理引起的CIDEC的基因和蛋白水平的下調。這表明在HepG2細胞中，NG25通過PPARγ調控CIDEC的表達，進而調節肝脂積累，即NG25調節肝臟脂滴積累的分子機制是NG25通過PPARγ-CIDEC信號通路來抑制肝臟脂滴的積累。

總之，NG25對HepG2細胞脂滴積累有抑制作用，機制可能是抑制PPARγ的轉錄，進而下調CIDEC表達，即通過PPARγ-CIDEC信號途徑最終抑制HepG2細胞脂滴積累。