SIVA1基因在胃癌組織中的表達變化及與化療藥物敏感性的關系

吳錕，孔凡彪，李雷，麥威，王曉通

1廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院，南寧 530021；2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和腫瘤相關致死率在所有惡性腫瘤中分別位居第四和第三[1]。化療對改善進展期胃癌和復發(fā)轉移型胃癌患者預后發(fā)揮重要作用，然而目前仍缺乏個體化治療方案選擇的有效指標，且化療過程中發(fā)生腫瘤耐藥也是導致化療后腫瘤復發(fā)或轉移的主要原因之一。因此，積極尋找具有判斷個體化療敏感性的指標，優(yōu)化化療個體治療方案，并切實有效地提高化療療效，對胃癌化療具有重要的意義，也是臨床迫切需要解決的難題。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過干擾胃癌細胞中SIVA1基因表達，可促進胃癌增殖，抑制胃癌凋亡，并增強胃癌對順鉑(CDDP)的耐藥性[2]。本研究采用免疫組化法檢測胃癌組織中SIVA1，三維組織塊體外藥敏法檢測CDDP、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星(ADM)對胃癌組織的抑制率，分析SIVA1表達與胃癌組織對藥物敏感性的相關性，初步探討SIVA1在指導胃癌個體化治療中的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年7月～2018年10月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科手術切除的新鮮胃癌組織和匹配的正常組織，胃癌組織經(jīng)術后病理確診，且所有患者術前均未接受放化療和生物治療。標本收集及處理：大體標本離體后，剖開胃體，用無菌紗布將腫瘤表面的血漬、黏液等污物擦拭干凈，避開肉眼可見的腫瘤壞死區(qū)域，分別切取新鮮胃癌組織和正常組織(距離癌腫邊緣3 cm以上)各2 cm3，將癌組織分為2部分，用于病理診斷和檢測SIVA1表達的癌組織(60例份)則置入4%多聚甲醛中，正常組織(60例份)也置入4%多聚甲醛進行固定，用于體外培養(yǎng)藥敏實驗的癌組織(30例份)放入含有雙抗(100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)的預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中；4 ℃條件下，將上述組織樣本在30 min內快速送至實驗室。進行藥敏實驗的組織經(jīng)過含雙抗的PBS漂洗數(shù)次去除黏液、血液等，眼科剪將其剪成大小約1 mm3的微組織塊并稱取其重量；其余組織標本經(jīng)甲醛固定24 h后，按常規(guī)石蠟包埋技術進行組織石蠟標本的制作，收集石蠟切片進行免疫組化實驗。

1.2 胃癌組織SIVA1檢測 采用免疫組化SP法。實驗操作步驟按試劑盒說明書進行，以PBS代替一抗做陰性對照，用抗體說明書上的已知陽性切片作陽性對照。由兩位中級職稱以上的病理醫(yī)師分別雙盲閱片進行結果判讀，每張切片隨機取5個高倍視野(400×)，每視野計數(shù)100個細胞。細胞染色強度定義和記分：無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；組織陽性細胞率定義和記分：陽性細胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；SIVA1表達強度為細胞染色強度記分和組織陽性細胞率記分乘積值：1表示陰性(-)，2～3為弱陽性(+)，4～7為陽性(++)，≥8為強陽性(+++)。定義表達強度≤3為表達陰性，≥4為表達陽性。

1.3 胃癌組織藥物敏感實驗 采用三維組織塊藥敏法(HDRA)進行藥物敏感性檢測[3～5]。具體操作步驟：在24孔板中每孔放入1份組織塊，隨后加入含有藥物的完全培養(yǎng)液，所加入的培養(yǎng)液以不致組織塊漂浮為準，每一種藥物設置6個重復孔，以不含藥物的培養(yǎng)液作為陰性對照組，放入37 ℃細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1周，培養(yǎng)期間更換培養(yǎng)液1次；棄去培養(yǎng)液，加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液以及100 μL濃度為0.1 mg/mL膠原酶溶液，與組織塊反應8 h；棄去上述液體，加入400 μL的DMSO溶解結晶紫，用酶標儀檢測波長為540 nm處的吸光度值。計算各藥物對腫瘤組織的抑制率=(1-T/C)×100%，其中T為實驗組每克腫瘤組織的吸光值，C為對照組每克腫瘤組織的吸光值。藥物的抑制率為每種受試藥物6孔抑制率的平均值。根據(jù)藥物在人體內的血漿峰濃度設定HDRA試驗中藥物測試濃度：CDDP測試濃度為20 μg/mL，5-FU測試濃度為300 μg/mL，ADM測試濃度為15 μg/mL[6～8]。

2 結果

2.1 胃癌和正常組織中SIVA1陽性率比較 胃癌和正常組織中SIVA1陽性率分別為25.0%(15/60)、88.3%(53/60)，兩者比較，P<0.05。胃癌和胃正常組織中SIVA1免疫組化染色情況(詳見圖1)。

圖1 胃癌和胃正常組織中SIVA1免疫組化染色情況

2.2 胃癌組織SIVA1陽性表達與化療藥物敏感性的關系 CDDP、5-FU、ADM對胃癌組織的抑制率分別為28.81%、28.20%、25.45%；以SIVA1表達強度為中位值將30例份胃癌組織分為相對高表達組(14例份)和相對低表達組(16例份)，CDDP、5-FU、ADM對相對低表達組的抑制率分別為23.40%±1.91%、30.94%±3.94%、29.20%±2.23%，三種藥物對相對高表達組的抑制率分別為34.59%±2.11%、26.71%±5.29%、25.44%±2.39%，兩組CDDP抑制率比較，P均<0.05。

3 討論

目前，胃癌患者接受的化療方案主要遵循美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南推薦的標準方案，然而在臨床應用過程中，這些標準化的治療方案卻忽略了腫瘤內在的異質性以及患者的個體化差異。由于腫瘤異質性以及個體差異的存在，使得不同的胃癌患者即便在接受相同的化療方案后，其生存結局亦有明顯差異，因此如何在選擇化療方案的過程中體現(xiàn)“精準個體化治療”是當前胃癌治療的主要研究方向。類似于細菌體外培養(yǎng)并進行藥敏實驗指導感染患者的針對性治療，腫瘤藥敏實驗在理論上也能指導臨床醫(yī)生制訂并為患者選擇合適的化療方案。經(jīng)過多年的研究，學者們深入探索了各種實體腫瘤在體外培養(yǎng)和藥敏實驗的方法，并將這些方法與患者的治療效果進行分析[9～11]。相對于腫瘤原代細胞培養(yǎng)等其他實驗方法，三維組織塊藥敏法(HDRA)具有操作便利性、實驗周期短、維持腫瘤組織三維組織結構等多種體內特性、可模擬細胞間質和細胞間相互信息傳導等優(yōu)勢，更接近于腫瘤在體內實際情況[12～14]。因此在本研究中，我們采用HDRA體外培養(yǎng)法對胃癌組織進行藥敏實驗，結果顯示30例胃癌標本均成功進行藥敏實驗，且實驗結果經(jīng)過標準化處理后相同藥物濃度對不同胃癌患者來源的腫瘤組織的抑制率存在不同程度的差異，提示HDRA法的可操作性。然而在實驗過程中仍需注意：①考慮到同一患者的腫瘤組織局部亦存在異質性，因此應設置多個重復孔；②組織塊的吸光度值應經(jīng)過組織塊重量的標準化處理，方有比較意義；③在處理組織塊時應使用含雙抗的PBS反復洗去表面的黏液和血漬等污物，以避免體外組織培養(yǎng)過程中發(fā)生病原微生物污染。

化療藥物殺傷腫瘤的一個重要作用方式是通過損傷細胞基因組DNA進而誘導細胞凋亡的發(fā)生，而DNA損傷修復增強、促進凋亡抵抗則是腫瘤耐藥發(fā)生的主要機制[15]，因此當?shù)蛲鱿嚓P分子或信號通路功能異常則可誘導腫瘤細胞發(fā)生化療耐藥。凋亡影響因子SIVA1不僅能參與p53引起的細胞凋亡[16]，還可通過抑制NF-κB的活性并誘導細胞發(fā)生凋亡[17]。此外，SIVA1還參與腫瘤細胞的化療耐藥過程。研究[18,19]表明，SIVA1可通過與多種受體結合并促進腫瘤細胞凋亡，從而增加腫瘤細胞對CDDP的敏感性。Ray等[20]發(fā)現(xiàn)，在p53缺失的結直腸癌細胞中，低表達的SIVA1是CDDP發(fā)揮誘導細胞凋亡作用的主要障礙之一。以上研究提示，SIVA1可通過影響細胞凋亡發(fā)揮抑癌基因的作用并參與腫瘤化療耐藥過程。我們此前研究也發(fā)現(xiàn)，下調胃癌耐CDDP的細胞株中的SIVA1表達后，細胞的耐藥性顯著增加且引起抗凋亡因子Bcl-2表達升高，提示SIVA1可通過細胞凋亡途徑調控胃癌細胞對CDDP的藥物敏感性。本研究顯示，SIVA1在胃癌組織中呈低表達，提示SIVA1作為抑癌基因參與胃癌的發(fā)生及發(fā)展。本研究還顯示，相比于低表達的組織，CDDP對SIVA1表達較高的胃癌組織具有更高的抑制率，提示SIVA1的表達水平可能對CDDP在胃癌中的治療具有一定參考作用；然而對于SIVA1與ADM、5-FU藥物敏感之間未見顯著性關聯(lián)，我們推測可能是SIVA1介導的凋亡相關信號通路與上述兩種藥物的作用機制不同所致，但這一推測仍需要進一步研究。

總之，SIVA1在胃癌組織中呈低表達，HDRA法能有效檢測化療藥物在體外對胃癌組織的抑制效應，胃癌組織中SIVA1表達與CDDP對胃癌組織的抑制率呈正相關，SIVA1可作為評價CDDP對胃癌治療效果的指標。