丹皮酚通過上調miR-424-3p和抑制PI3K/AKT信號通路影響肝癌細胞的生長和遷移*

孫新鋒，韓志毅，馮文杏，馬文峰，張 衛，周小舟

［廣州中醫藥大學第四臨床醫學院（深圳市中醫院）肝病科，廣東深圳518033］

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC；簡稱“肝癌”）是全球第六大最常見的惡性腫瘤，更是導致腫瘤相關死亡的第三大原因［1］。由于肝癌的早期有效診斷較為困難，僅20%肝癌患者能夠通過肝移植、手術切除或消融治療，部分患者甚至出現復發或轉移；晚期肝癌患者預后較差，死亡率高［2］，因此探討新的輔助療法至關重要。丹皮酚（paeonol，Pae）別名牡丹醇，是牡丹花根皮提取物的主要活性成分，具有鎮靜催眠、解熱鎮痛、抗炎、抗氧化等多種藥理和生理作用［3］。此外，丹皮酚還具有抑制腫瘤形成、降低腫瘤轉移能力的作用［4-5］。但丹皮酚對肝癌細胞轉移的影響尚不清楚。微小RNA-424-3p（microRNA-424-3p，miR-424-3p）是一種與肝癌相關的關鍵mi?croRNA，與端粒維持、蛋白泛素化、組蛋白代謝等多個生物學過程密切相關［6］。研究顯示白藜蘆醇通過上調 miR-424-3p 表達促進卵巢癌細胞凋亡［7］，但miR-424-3p 在肝癌中的作用并未被闡明。我們推測丹皮酚對肝癌的抗腫瘤作用可能與調控miR-424-3p表達有關，因此本研究通過觀察丹皮酚對肝癌細胞活力、遷移能力及miR-424-3p表達的影響，初步揭示丹皮酚抗腫瘤作用的分子機制，以期為丹皮酚在肝癌輔助治療中的應用奠定理論依據。

材料和方法

1 細胞與試劑

人HCC細胞株Hep3B購于中國科學院細胞研究所。DMEM 培養基和胎牛血清購于HyClone；Lipo?fectamineTM2000、青-鏈霉素雙抗和Trizol 試劑購于Invitrogen；Transwell 小室購于BD；抗磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）抗體和抗磷酸化的蛋白激酶B（phos?phorylated protein kinase B，p-AKT）抗體購于上海賽信通公司；抗細胞周期素D1（cyclin D1）抗體、抗基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）抗體、抗MMP9 抗體及辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG 購于上海艾博抗公司；miR-424-3p 模擬物（miR-424-3p mimics）、模擬物陰性對照（miR-NC）、抑制物陰性對照（anti-miR-NC）和miR-424-3p 抑制物（antimiR-424-3p）由上海吉瑪制藥公司提供；細胞計數試劑盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒購于上海碧云天公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養和實驗分組 采用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM 培養基于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養Hep3B 細胞。取對數生長期的Hep3B 細胞進行實驗，采用含不同濃度（50、10、200 和400 mg/L）丹皮酚的細胞培養液干預Hep3B 細胞24 h，CCK-8 法檢測細胞活力，計算細胞相對活力，以確定丹皮酚的最佳使用濃度。將細胞分為：正常對照（normal control，NC）組（正常培養的Hep3B細胞）、丹皮酚組（采用丹皮酚濃度為200 mg/L 的細胞培養液干預細胞24 h）、miR-NC 組（將miR-NC 瞬時轉染至Hep3B 細胞）、miR-424-3p 組（將miR-424-3p mimics 瞬時轉染至Hep3B 細胞）、丹皮酚+anti-miRNC 組（轉染 anti-miR-NC 同時采用 200 mg/L 的丹皮酚干預處理）和丹皮酚+anti-miR-424-3p 組（轉染an?ti-miR-424-3p 同時采用200 mg/L 的丹皮酚干預處理）。細胞轉染按照LipofectamineTM2000 使用說明書步驟進行。

2.2 RT-qPCR 檢測miR-424-3p 的表達水平 待細胞按照上述分組進行干預后，棄去細胞培養液，PBS洗滌細胞3 次，采用Trizol 試劑提取細胞RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度，調整A260與A280比值在1.8～2.0 之間。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，隨后進行實時定量PCR 擴增。miR-424-3p 的上游引物序列為 5′-CGCAAAACGTGAG?GCGCT-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；內參照U6 的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物序列為 5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。運用 2-ΔΔCt法分析miR-424-3p的表達水平。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 將Hep3B 細胞按照每孔1×104的密度接種于96孔板，按照細胞分組進行干預后，每孔加入10μL 的CCK-8 試劑，培養箱繼續孵育2 h，酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的A值，換算為細胞相對活力。

2.4 Transwell 法檢測細胞遷移能力 待細胞按照上述分組進行干預后，棄去細胞培養液，PBS洗滌細胞3 次，采用無血清細胞培養基調整細胞密度為1×108/L。將Transwell 小室至于24 孔板中，上室加入300 μL 細胞懸液，24 孔板下室加入500 μL 含20%胎牛血清的細胞培養液，培養箱孵育24 h 后，取出小室，棉簽拭去上室未遷移細胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min，結晶紫染色5 min，PBS 沖洗晾干后，倒置于顯微鏡下拍照，隨機選取5 個視野進行細胞計數，拍照，以其均值表示細胞遷移數目。

2.5 Western blot 檢測 cyclin D1、MMP2、MMP2 及PI3K/AKT 信號通路相關蛋白的水平 待細胞按照上述分組進行干預后，收集各組細胞，常規方法提取細胞總蛋白，BCA 法定量后，將細胞蛋白和上樣緩沖液混合，沸水浴5 min變性，按照每泳道30μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE。隨后將細胞蛋白轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h，再與稀釋的Ⅰ抗室溫孵育2 h，與稀釋的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后，最后于暗室進行化學發光顯色。以β-actin 為內參照，ImageJ 軟件測定各目的條帶的灰度值，分析cyclin D1、MMP2 和MMP2 的相對表達水平。為檢測丹皮酚調控miR-424-3p 表達對PI3K/AKT 信號通路的影響，按照上述方法檢測p-PI3K和p-AKT蛋白的水平。

3 統計學處理

采用SPSS 18.0 進行統計學分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 不同濃度丹皮酚對Hep3B細胞活力的影響

與NC 組比較，丹皮酚組Hep3B 細胞活力顯著降低（P＜0.05），且隨著丹皮酚濃度的逐漸增加，其對細胞活力的抑制作用逐漸增強，見圖1。我們選擇200 mg/L的丹皮酚進行后續研究。

2 丹皮酚對Hep3B 細胞遷移能力和miR-424-3p 表達水平的影響

與NC 組比較，丹皮酚組Hep3B 細胞的MMP2 和MMP9蛋白表達水平顯著降低，細胞遷移數量顯著減少，而miR-424-3p表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖2和表1。

Figure 1.Effect of different concentrations of paeonol（Pae）on the viability of Hep3B cells.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖1 不同濃度丹皮酚對Hep3B細胞活力的影響

Figure 2.Effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the protein expression of MMP2 and MMP9 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.圖2 丹皮酚對Hep3B 細胞遷移能力及MMP2 和MMP9 蛋白表達水平的影響

3 過表達miR-424-3p 對Hep3B 細胞活力和遷移能力的影響

與 miR-NC 組比較，miR-424-3p 組 Hep3B 細胞miR-424-3p 的表達水平顯著升高，cyclin D1、MMP2和MMP2 蛋白的表達水平顯著降低，細胞活力顯著降低，細胞遷移數目顯著降低（P＜0.05），見圖3和表2。

表1 丹皮酚對Hep3B 細胞遷移、miR-424-3p 表達及MMP2和MMP9蛋白表達水平的影響Table 1.Effects of paeonol（Pae）on migration of Hep3B cells，miR-424-3p expression，and MMP2 and MMP9 pro?tein expression in Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 3.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in Hep3B cells.A：the cell migration ability was determined by Transwell assay（crystal vio?let staining，×100）；B：the protein expression was de?tected by Western blot.圖3 過表達miR-424-3p 對Hep3B 細胞遷移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達的影響

4 抑制miR-424-3p 表達部分逆轉丹皮酚對Hep3B細胞活力和遷移能力的影響

與丹皮酚+anti-miR-NC 組比較，丹皮酚+antimiR-424-3p 組 Hep3B 細胞 miR-424-3p 的表達水平顯著降低，cyclin D1、MMP2 和 MMP2 蛋白的表達水平顯著升高，細胞活力顯著增強，細胞遷移數目顯著增多（P＜0.05），見圖4和表3。

5 PI3K/AKT信號通路相關蛋白水平的變化

與NC組比較，丹皮酚組Hep3B細胞p-PI3K和p-AKT 蛋白的水平顯著降低；與丹皮酚+anti-miR-NC組比較，丹皮酚+anti-miR-424-3p 組Hep3B 細胞p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

表2 過表達miR-424-3p 對Hep3B 細胞遷移能力及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達的影響Table 2.Effect of miR-424-3p over-expression on the migration ability and the protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 4.Inhibition of miR-424-3p partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the migration ability and the pro?tein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells.A：the cell migration ability was deter?mined by Transwell assay（crystal violet staining，×100）；B：the protein expression was detected by Western blot.圖4 抑制miR-424-3p 部分逆轉丹皮酚對Hep3B 細胞遷移能力和MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達的影響

表3 抑制miR-424-3p 部分逆轉丹皮酚對Hep3B 細胞活力、遷移及MMP2、MMP9和cyclin D1蛋白表達的影響Table 3.Inhibition of miR-424-3p expression partially reversed the effect of paeonol（Pae）on the viability，migration ability and protein expression of MMP2，MMP9 and cyclin D1 in the Hep3B cells（Mean±SD. n=9）

Figure 5.The protein levels of p-PI3K and p-AKT in the Hep3B cells were determined by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs Pae+anti-miRNC group.圖 5 Western blot 檢 測 Hep3B 細胞中 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的水平

討 論

據報道，全球每年約70 萬人死于肝癌［8］。盡管肝癌診療手段不斷發展，但肝癌的頻繁復發和高轉移率仍是影響肝癌患者生存率的主要因素。丹皮酚是一種廣譜抗腫瘤藥物。研究顯示，丹皮酚在體內外對前列腺癌細胞生長均有抑制作用［9］；丹皮酚還可通過激活caspase-3途徑和下調生存素表達誘導卵巢癌細胞凋亡［10］；丹皮酚通過下調胃癌細胞MMP2和MMP9 表達具有抑制腫瘤細胞生長、遷移和侵襲的作用［11］。此外，丹皮酚還可通過抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用［12］，但其對肝癌細胞遷移能力的影響尚未可知。本研究采用不同濃度丹皮酚干預Hep3B 細胞，結果顯示丹皮酚呈劑量依賴性地抑制Hep3B 細胞活力，與既往研究結果一致［13］。進一步研究顯示丹皮酚還可抑制MMP2 和MMP9 表達，降低Hep3B 細胞的遷移能力。這些結果提示丹皮酚具有抗肝癌細胞轉移的作用。

miR-424-3p 在非小細胞肺癌中表達下調，與非小細胞肺癌患者病情進展和總體預后明顯相關，上調miR-424-3p 明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲［14］；miR-424-3p在前列腺癌中表達下調，與臨床生存期和侵襲性表型顯著相關［15］。本研究顯示丹皮酚干預后Hep3B 細胞miR-424-3p 的表達水平顯著升高，提示丹皮酚的抗腫瘤作用可能與上調miR-424-3p 表達有關。過表達 miR-424-3p 后 Hep3B 細胞 cy?clin D1、MMP2 和 MMP9 表達水平顯著降低，細胞活力和遷移能力顯著降低，與丹皮酚的抗腫瘤作用一致。進一步研究顯示，抑制miR-424-3p 表達可逆轉丹皮酚對Hep3B 細胞活力和遷移能力的影響。這提示丹皮酚通過上調miR-424-3p表達抑制肝癌細胞的活力和遷移能力。

PI3K/AKT 信號通路在多種腫瘤存在異常活化，與腫瘤細胞的生長、代謝、增殖和轉移密不可分。研究顯示索菲拉尼通過抑制PI3K/AKT 信號通路活化可抑制肝臟腫瘤的生長［16］；白藜蘆醇通過抑制PI3K/AKT 通路抑制肝癌細胞的增殖和遷移［17］。Xu 等［18］研究顯示miR-424-3p對前列腺癌細胞的抗增殖作用可能與抑制PI3K/Akt 通路有關。此外，丹皮酚還可通過抑制PI3K/Akt通路促進放射誘導的肺腺癌細胞凋亡［19］。本研究顯示丹皮酚干預后Hep3B細胞PI3K和AKT 的磷酸化水平顯著降低，PI3K/AKT 信號通路受到抑制，而抑制miR-424-3p 表達可逆轉丹皮酚對Hep3B 細胞PI3K/AKT 信號通路的抑制作用。這提示丹皮酚在肝癌中的抗腫瘤作用與調控PI3K/AKT通路有關。

總之，丹皮酚可上調miR-424-3p 表達和抑制PI3K/AKT 信號通路，進而有效抑制肝癌細胞的活力和遷移。本研究為丹皮酚在肝癌輔助治療中的應用奠定了理論基礎。