柴胡疏肝湯對自發性高血壓大鼠ROCK/JNK信號通路及動脈粥樣硬化的影響*

王鴻燕，黃正新，及 孟，趙月娥

（海南省中醫院心血管科，海南海口570203）

高血壓病是由多種病因相互作用引起的一種心血管綜合征，隨著社會發展，其發病率逐年增加，且越來越年輕化。研究報道，我國青少年高血壓的患病率約15%，15 歲及以上人群高血壓患病率高達24%，青少年罹患高血壓增加其成年期心血管疾病發生的風險［1-2］。高血壓病會導致全身循環動脈壓升高，對其靶器官造成嚴重損傷，包括動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）、動脈內膜增厚、心室肥大等。目前，大量研究表明，高血壓引起體內激烈的氧化應激反應造成內皮功能障礙，而血管內皮損傷與AS 的發生密切相關［3-4］。AS 是由于脂質超載巨噬細胞的積累導致動脈狹窄、泡沫細胞形成［5］。AS 不同階段依賴于氧化應激、內皮功能障礙和炎癥，而高血壓或血脂異常可獨立觸發AS 不同階段發生［6］。Rho 相關激酶（Rho-associated kinase，ROCK）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路與高血壓動脈功能相關［7］。柴胡疏肝湯（Chaihu-Shugan de?coction，CHSGD）有疏肝理氣的功能，在高血壓病舌象和代謝綜合征中發揮重要作用，推測CHSGD 對高血壓及AS 有一定治療作用［8］。本研究觀察CHSGD對自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）ROCK/JNK信號通路及AS的影響，以期為CHSGD臨床治療高血壓病提供一定科學依據。

材料和方法

1 實驗動物

8 周齡雄性 Wistar SHR 50 只，體質量（250.12±5.04）g，同周 齡雄性 Wistar 大 鼠 10 只 ，體質 量（249.36±4.35）g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號為SCXK（京）2018-0013，動物使用許可證號為SYXK（京）2018-0027。動物單籠單只飼養，自由取食飲水，適應性飼養1 周后進行實驗。本研究經海南省中醫院倫理委員會批準［批準號：2018（倫審）0137］。

2 試劑及儀器

CHSGD 由柴胡 6 g、陳皮 6 g、芍藥 4.5 g、香附4.5 g、枳殼 4.5 g、川芎 4.5 g 和炙甘草 1.5 g 組成，加水 1 000 mL，浸泡 1 h，煎煮 30 min，煎 2 次，用 200 目濾網過濾去渣，將藥液采用旋轉蒸發儀濃縮，生藥終濃度分別為0.25、0.5 和1 kg/L，消毒冷藏備用；復方羅布麻（compound kendir leaves，CKL；國藥準字H14023052；片劑；批號20190713）購自山西津華暉星制藥有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（貨號50107ES50）購自上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號GL2091）購自北京百奧萊博科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號JT9344）購自北京吉美生物技術有限公司；抗RhoA抗體（貨號 ab187027）、抗 ROCK1 抗體（貨號ab45171）和抗 JNK 抗體（貨號 ab112501）購自 Ab?cam；辣根過氧化物酶標記的II 抗（貨號BHR101）購自北京博爾西科技有限公司；RIPA 組織裂解液（貨號SF1347）和BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（貨號P0010S）購自上海碧云天公司。

智能無創血壓計（型號BP-2010E）購自北京軟隆生物技術有限公司；蛋白電泳及電轉移裝置（型號AU5800）購自北京市六一儀器廠；酶聯免疫分析儀（型號EVO75）購自Tecan；全自動生化分析儀（型號7020）購自Hitachi；正置光學顯微鏡（型號Eclipse Ci）購自Nikon；超低溫冰箱（型號MDF-U32V）購自Thermo。

3 方法

3.1 實驗分組及干預 將50 只雄性Wistar SHR 隨機分為模型（model）組、CKL 組和 CHSGD 低、中、高劑量（CHSGD-L、CHSGD-M 和CHSGD-H）組，另選10只同源雄性Wistar 大鼠為正常對照（normal control，NC）組。CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H組大鼠分別用 2.5、5 和 10 g/kg 的 CHSGD 灌胃［9］（生藥終濃度分別為 0.25、0.5 和 1 kg/L，灌胃體積 10 mL/kg），分別是臨床劑量的 0.4、0.8 和 1.6 倍；CKL 組用 0.5 g/kg CKL 灌胃［10］，灌胃體積 10 mL/kg；model 組和NC組大鼠用等體積（10 mL/kg）生理鹽水灌胃。灌胃每日1次，連續4周。

3.2 各組大鼠生化指標的檢測 治療前和治療4周后，在大鼠清醒平靜狀態下采用智能無創血壓計測量鼠尾動脈血壓。治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，從腹主動脈快速取血，離心取上清，采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血脂相關指標甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cho?lesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density li?poprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平；嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測血清中氧化應激相關指標NO、MDA和SOD的水平。

3.3 HE 染色觀察各組大鼠主動脈組織的病理變化 治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，取主動脈弓以下的主動脈，固定，常規石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟、乙醇水洗、HE 染色、常規脫水，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察拍照。

3.4 Western blot 檢測主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK 的蛋白表達 治療4 周后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，取主動脈，使用組織裂解液提取主動脈組織總蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度后，進行SDS-PAGE，轉膜，加I抗（RhoA、ROCK1、JNK 和β-ac?tin 抗體，1∶2 000）4 ℃孵育過夜，次日洗膜后加辣根過氧化物酶標記的II抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜后加ECL 發光液，在凝膠成像系統中拍照，并進行灰度分析。

4 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 22.0進行數據分析，計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠血脂水平的變化

治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；與CKL 組相比，CHSGD-L和 CHSGD-M 組大鼠血清 TG、TC 和 LDL-C 水平顯著升高（P＜0.05），而 CHSGD-H 組與 CKL 組大鼠血清TG、TC 和 LDL-C 水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表1。

2 各組大鼠血壓的變化

治療前，與 NC 組相比，model、CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血壓顯著升高（P＜0.05）。治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血壓顯著升高（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠血壓顯著降 低（P＜0.05）；與 CKL 組 相 比 ，CHSGD-L 和CHSGD-M 組 大 鼠 血 壓 顯 著 升 高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與CKL 組大鼠血壓的差異無統計學顯著性（P＞0.05）。見表1。

3 各組大鼠主動脈組織的病理變化

HE 染色結果顯示，NC 組大鼠內膜光滑平整，管壁細胞分布整齊，各層結構正常；model 組大鼠主動脈管徑增厚，內皮下大量泡沫細胞形成，平滑肌細胞增生，排列紊亂；CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和CHS?GD-H 組大鼠主動脈各層結構逐漸恢復正常，血管細胞排列較整齊，炎癥細胞浸潤較輕，見圖1。

4 各組大鼠血清中NO、MDA和SOD水平的變化

治療 4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠血清NO 和 SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 組大鼠血清NO 和SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低（P＜0.05）；與 CKL 組相比，CHSGD-L 和 CHSGD-M 組大鼠血 清 NO 和 SOD 水平顯 著 降 低 ，MDA 水平顯著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與 CKL 組大鼠血清 NO、SOD 和 MDA 水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表2。

5 各組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK蛋白表達的比較

治療4 周后，與 NC 組相比，model 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與 model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGD-M和CHSGD-H 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與CKL 組相比，CHSGD-L 和CHSGD-M 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），而CHSGD-H 組與CKL 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見圖2及表2。

表1 各組大鼠血脂和治療前后血壓水平變化的比較Table 1.The changes of blood lipids after 4 weeks of treatment and the changes of blood pressure before and 4 weeks after treatment in the rats with different interventions（Mean±SD. n=10）

Figure 1.The images of the aorta with HE staining（×400）.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGD-H group.圖1 各組大鼠主動脈組織HE染色圖

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments.a：NC group；b：model group；c：CKL group；d：CHSGD-L group；e：CHSGD-M group；f：CHSGDH group.圖2 Western blot檢測各組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白的表達

表2 各組大鼠血清中NO、MDA和SOD水平及主動脈組織中RhoA、ROCK1和JNK蛋白表達的比較Table 2.The serum levels of NO，MDA and SOD，and the protein expression of RhoA，ROCK1 and JNK in the aorta of the rats with different treatments（Mean±SD. n=10）

討 論

高血壓和血脂異常是AS的獨立危險因素，AS也是高血壓和心肌梗塞等心血管疾病的危險因素［11-12］。研究表明，SHR 體內血脂異常，血清內皮素1（endo?thelin-1，ET-1）、TC、TG 和 LDL-C 水平顯著升高［13］。本研究發現，治療4 周后，與NC 組相比，model 組大鼠血壓及血清中TG、TC 和LDL-C 水平顯著升高，提示SHR 存在高血壓和血脂異常癥狀。HE 染色可見model組大鼠主動脈管徑增厚，內皮下大量泡沫細胞形成，平滑肌細胞增生，排列紊亂，提示SHR 可能通過發生高血壓造成血脂異常，從而使主動脈發生病變，出現AS癥狀。

高血壓患者會出現頭痛、頭暈、尿液增多、胸悶、乏力等癥狀，臨床上常用利尿藥、鈣通道阻滯劑、血管張素轉換酶抑制劑等降壓藥，但長期服用對患者身體和經濟造成較大的負擔。中草藥具有副作用小、成本低等特點，CHSGD 由柴胡、陳皮、芍藥、香附、枳殼、川芎和炙甘草七味中藥組成，為理氣劑，主要歸心、肝、腎經，具有疏肝理氣、活血止痛之功效［14-15］。《神農本草經》記載，柴胡性微寒，味苦、辛，歸肝經、膽經，具透表泄熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效，用于肝郁氣滯、脅肋脹滿疼痛及肝郁血虛，與高血壓患者頭痛、頭暈等癥狀吻合。研究表明，柴胡疏肝散可以降低高血壓患者TG、TC 和LDL-C 的水平，具有調節脂質代謝、降血壓作用［8］。本研究發現，治療4 周后，與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 組大鼠血壓及血清中 TG、TC 和 LDLC 水平顯著降低，CHSGD-H 組大鼠血壓及血清中TG、TC和LDL-C水平與CKL組相比無顯著差異；HE染色可見 CKL、CHSGD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠主動脈各層結構逐漸恢復正常，血管細胞排列較整齊，炎癥細胞浸潤較輕，提示CHSGD 可降低SHR 血壓，改善血脂情況，減輕主動脈損傷，緩解AS癥狀，且其濃度增加則作用增強。

高血壓病導致的血管內皮損害會造成血脂異常患者的血管舒縮功能喪失，血管收縮不均衡和血壓升高［16］。而高血壓患者中，血壓的進一步升高會形成自我延續的惡性循環，加劇惡性高血壓病的發展和AS 病變進程。SOD 是評價氧化應激反應程度的指標；MDA 是自由基過氧化脂質的分解產物，是衡量脂質過氧化程度的重要指標；NO是由血管內皮細胞產生并釋放的，可以反映血管內皮依賴性舒張功能［17］。本研究發現，與 NC 組相比，model 組大鼠 NO和SOD 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高，提示高血壓病發生與氧化應激反應相關。柴胡疏肝散可以降低 MDA 和 SOD 表達，抑制脂質過氧化反應［18］。本研究發現，與model 組相比，CKL、CHSGD-L、CHSGDM 和 CHSGD-H 組大鼠血清 NO 和 SOD 水平顯著升高，MDA 水平顯著降低，提示CHSGD 可能通過下調脂質過氧化產物MDA 及上調NO 和SOD 表達減輕氧化應激反應，降低血壓，從而改善血管舒張功能。

ROCK1是RhoA 下游靶基因，與細胞增殖、遷移等功能相關。最近大量研究表明，RhoA/ROCK 通路在高血壓、AS、糖尿病等疾病中發揮重要作用［19］。JNK 又稱為應激活化蛋白激酶（stress-activated pro?tein kinase，SAPK），屬于MAPK 家族，在胞外基質的代謝和AS 形成中發揮重要作用。研究表明，抑制ROCK/JNK信號通路，可以減少血管平滑肌細胞過度遷移，減輕血管內膜增厚，與AS、心肌梗塞、中風等心血管疾病密切相關［20］。本研究發現，治療4 周后，與NC 組相比，model 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達顯著升高，提示RhoA、ROCK1和JNK可能參與自發性高血壓的發生發展進程。進一步研究發現，與model 組相比，CKL、CHS?GD-L、CHSGD-M 和 CHSGD-H 組大鼠主動脈組織中RhoA、ROCK1 和 JNK 蛋白 表達顯 著降 低 ，提 示CHSGD可能通過抑制ROCK/JNK 信號通路相關因子RhoA、ROCK1 和JNK 蛋白表達，減緩氧化應激反應，減輕AS癥狀。

綜上所述，CHSGD 可抑制氧化應激反應，減輕AS 癥狀，可能是通過下調ROCK/JNK 信號通路相關蛋白RhoA、ROCK1 和JNK 表達實現的，但其具體作用機制仍需進一步研究。