Sema4D對RSV所致哮喘大鼠Th1/Th2的免疫調節及咳喘寧口服液的干預作用*

伍 晴，羅銀河△，王孟清，陳瑩瑩，馬曉萌，胡 燕

（1湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）的免疫學機制是Th1/Th2 細胞功能失衡，Th2 免疫應答優勢，刺激其他細胞產生一系列炎癥介質，最終誘發速發型變態反應和慢性氣道炎癥［1］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起小兒呼吸道黏膜感染的常見病原體，與哮喘的發病存在明顯關系。RSV 是單鏈RNA 病毒，其中所含的F 蛋白主要引起Th1 型炎癥反應，G 蛋白主要引起Th2 型炎癥反應，因此RSV感染可以導致以上2種炎癥反應的失衡，可能是引起哮喘的因素［2］。腦信號蛋白4D（semxpahorin 4D，Sema4D）在慢性病毒持續感染中發揮重要作用，但是否參與RSV所致哮喘大鼠Th1/Th2的免疫調節，尚待研究［3］。

本研究通過RSV 復合卵清蛋白（ovalbumin，OVA）構建哮喘大鼠模型，觀察Sema4D 對RSV 所致哮喘大鼠Th1/Th2 的免疫調節及咳喘寧（Kechuan?ning，KCN）灌胃處理對哮喘大鼠肺組織病理改變和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中相關炎癥因子的影響，為闡明咳喘寧通過調節Sema4D 減輕RSV 所致哮喘氣道免疫炎癥提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性Wistar大鼠100只，90～110 g，28～35日齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。

1.2 藥物與試劑 咳喘寧口服液（主要由炙麻黃、苦杏仁、細茶葉、桃仁、大青葉、生石膏、黃芪、甘草等組成）由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供［（湘）衛藥劑（06）05第085號］，每瓶100 mL，含生藥70 g。按臨床量效關系確定咳喘寧口服液低、中、高劑量分別為0.33、3和10 mL/kg。RSV 和人喉癌上皮Hep-2 細胞（武漢大學病毒研究所）。雞OVA（Solarbio）；Sema4D 重組蛋白（Sino Biological，生產批號80320-R08H）；抗Sema4D 抗體（Bioss，生產批號bs-6965R）；白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的ELISA 試劑盒（上海晶天生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 大鼠RSV 復合OVA 哮喘模型的制備 將大鼠隨機分為正常（normal）組（10 只）和哮喘模型組（90只）。參照文獻建立急性哮喘大鼠模型［4-6］，以滴度為1.0×109空斑形成單位（plaque-forming unit，PFU）/L的 RSV 50 μL 鼻腔滴入，第 2 天相同劑量加強 1 次，第 2～7 天正常飼養，從第 7 天開始給予 1%OVA 隔天霧化吸入，每次30 min，持續2 周；正常組在相同時間、相同劑量下予Hep-2 細胞滴鼻吸入及生理鹽水霧化。造模結束后選取6 只模型組大鼠進行氣道反應性檢測，大鼠氣道反應性升高并出現噴嚏、鼻腔分泌物增多、呼吸加快等行為學表現提示造模成功。

2.2 動物分組及給藥 將造模成功的大鼠按隨機數字表法分為9 組，每組6 只，包括：模型（model）組；Sema4D 組（0.01 mg/kg Sema4D 重組蛋白腹腔注射）；Sema4D 抗體組（0.01 mg/kg Sema4D 抗體腹腔注射）；咳喘寧低、中、高劑量組（以低、中、高劑量的咳喘寧口服液灌胃）；Sema4D+咳喘寧低、中、高劑量組（以Sema4D 腹腔注射及低、中、高劑量的咳喘寧口服液灌胃）。正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，共2周。

2.3 標本采集

2.3.1 BALF 采集 對經方法2.2 治療2 周后的所有大鼠進行胸腔麻醉后用細線綁好四肢及頭部，固定在無菌鼠板上，用手術剪逐層剪開大鼠胸頸部皮膚和筋膜，分離頸部血管，一側氣管結扎，注入0.5 mL PBS 進行支氣管肺泡灌洗，反復3 次，收集BALF（回收率＞80%為合格），4℃離心15 min，取上清液于-80℃冰箱保存。

2.3.2 肺臟標本處理 完整分離出大鼠兩側肺臟，一側于4%多聚甲醛浸泡固定，另一側于-20℃冷凍保存。

2.4 肺組織學檢查 將經4%多聚甲醛溶液固定的肺組織，常規脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟和水化，然后進行HE 染色，于光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織病理學變化。

2.5 BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 含量的檢測 根據ELISA 試劑盒說明書的步驟，依次檢測 BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 的含量。通過標準曲線計算其濃度。

3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析。所有數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多樣本間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠肺組織HE染色結果

HE 染色結果顯示，正常組大鼠支氣管黏膜上皮無變形，肺泡及血管形態規整，無細胞脫落，無明顯炎癥細胞滲出、浸潤；模型組、Sema4D 組及Sema4D+咳喘寧低劑量組大鼠支氣管及血管周圍可見明顯的炎癥細胞浸潤，管壁各層可見嗜酸性粒細胞和單核細胞等炎性團塊聚集，肺泡形態不規整，含大量杯狀細胞，黏膜上皮局部脫落，黏膜下水腫；Sema4D抗體組、咳喘寧低、中、高劑量組及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組上述病理變化均較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少，肺泡形態較為規整，見圖1。

Figure 1.HE staining of lung tissues of the rats in different groups（scale bar=100 μm）.A：normal group；B：model group；C：Sema4D group；D：Sema4D antibody group；E：low dose of KCN group；F：middle dose of KCN group；G：high dose of KCN group；H：Sema4D+low dose of KCN group；I：Sema4D+middle dose of KCN group；J：Sema4D+high dose of KCN group.圖1 各組大鼠肺組織HE染色

2 BALF中各種炎癥因子含量的比較

ELISA 結果顯示，與正常組相比，其余各組BALF 中 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量都有不同程度的升高，IFN-γ 顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組相比，Sema4D 組 IL-4、IL-6、IL-8 和 TNF-α 的含量顯著升高，IFN-γ 的含量降低（P＜0.05 或P＜0.01），Sema4D 抗體組，咳喘寧低、中、高劑量組，以及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組的IL-4、IL-6、IL-8 和TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.01），IFN-γ 顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），而Sema4D+咳喘寧低劑量組上述指標的差異無統計學意義（P＞0.05）；與咳喘寧低、中、高劑量組相比，Sema4D 抗體組及Sema4D+咳喘寧中、高劑量組上述指標均無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

Figure 2.Comparison of the levels of inflammatory factors in BALF of the rats in different groups.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.圖2 各組大鼠BALF中炎癥因子含量的比較

討 論

RSV 感染可引起Th1 和Th2 兩大功能亞群的炎癥反應，Th1 細胞主要介導細胞免疫，即殺滅病毒和其他胞內病原體，其產生的IFN-γ可以抑制炎癥因子IL-4 的水平，IL-4 過高會促進免疫球蛋白E 的生成，誘發機體反復喘息，因此通過IFN-γ抑制IL-4可以避免患兒進一步發展成哮喘［7-8］；Th2 細胞介導變態反應，其產生的IL-4和IL-6促進了IgE 的合成及嗜酸性粒細胞在氣道內的聚集、活化和釋放細胞因子，可引起哮喘的慢性炎癥和氣道高反應性，刺激成纖維細胞增生及杯狀細胞分化，參與氣道重建［9］。RSV感染后，呼吸道單核吞噬細胞、內皮細胞、上皮細胞等產生的IL-8 和TNF-α，可介導炎癥細胞聚集并破壞上皮/內皮結構，參與炎癥反應及氣道重塑［10］。IL-8 和TNF-α 在RSV 感染誘發哮喘的發病機制中具有重要作用［11-12］。

Sema4D 在免疫炎癥發揮關鍵的調控作用［13］，且Sema4D是Th2驅動型哮喘病理生理過程的重要調節因子，Sema4D缺失可能會抑制肺部Th2 細胞因子的產生［14-15］。本研究結果證實，Sema4D 可使哮喘大鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α水平升高，IFN-γ含量降低，引起Th1/Th2 失衡，加重哮喘癥狀；Sema4D抗體組的炎癥因子濃度與正常組無顯著差異，說明通過干預Sema4D 可以減少炎癥因子的產生，糾正Th1/Th2失衡。

咳喘寧口服液以傳統古方五虎湯為基本方研制而成，具有發表清熱、化痰和平喘的功效，在臨床上用以防治病毒感染引起的哮喘，療效肯定，且與Th亞群調節作用相關［16］。本研究結果表明，咳喘寧對RSV 所致哮喘有效，且Sema4D 聯合咳喘寧中、高劑量組BALF 中炎癥因子濃度與咳喘寧各劑量組相比無顯著差異，說明咳喘寧可能通過干預Sema4D，調節Th1/Th2失衡，減輕免疫炎癥，以達到治療效果。

綜上所述，本研究結果表明，咳喘寧可能通過干預Sema4D，調節Th1/Th2 免疫失衡，減少炎癥因子產生，從而抑制RSV所致哮喘大鼠的免疫炎癥。