miR-433在NIH-3T3細胞纖維化和矽塵誘導的小鼠肺纖維化中的作用*

郭義威，孫春莉，王樹興

（新鄉醫學院人體解剖學教研室，河南新鄉453003）

纖維化的病理特征主要為斑塊狀慢性間質炎癥，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積，成纖維細胞增殖，進而導致病變組織進行性纖維化和功能的喪失。盡管在實驗和臨床方面對纖維化進行了廣泛研究，但仍缺乏有效的治療方法［1-2］。因此探索并闡明纖維化疾病的機制尤為重要。

轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）被公認為是主要的致纖維化細胞因子，在肺組織中TGF-β1 主要分布于支氣管上皮細胞、增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞和巨噬細胞中［3］。TGF-β1可以調控上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT），從而誘導多種纖維化細胞分化成纖維母細胞［4］。同時大量研究發現，在肺纖維化中TGF-β1/SMADs 信號通路異常表達可引起膠原沉積、成纖維細胞趨化、EMT等［5］。

微小RNA（microRNA，miRNA，miR）作為一種非編碼RNA，在細胞增殖、分化、凋亡、炎癥損傷、組織發育及修復過程中發揮著十分重要的作用，這些廣泛的生物學作用使其成為疾病治療的新靶點及診斷和預后判斷的生物標志物。雖然當前已有報道表明多種 miRNA 在纖維化中發揮了重要作用［6-7］，然而，miRNA 如何調控肺纖維化（尤其是矽肺），目前仍未知。本研究旨在觀察miR-433 在纖維化中發揮的作用，分析miR-433 對矽塵誘導的小鼠肺纖維化的影響，并進一步研究miR-433 在TGF-β1 誘導的成纖維細胞纖維化中的作用。

材料和方法

1 實驗動物和主要試劑

選取 6～8 周齡 C57BL/6 健康雄性小鼠 18 只，體重19～24 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2017-0001，清潔環境喂養。小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3 購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。青-鏈霉素溶液和胎牛血清均購于Ther?mo Fisher Scientific；miR-433 和內參照 U6 的引物購自 QIAGEN；TGF-β1 購自 PeproTech；Trizol 試劑購自Invitrogen；HE 染色試劑盒和Masson 染色試劑盒購自南京建成生物技術研究所；雙螢光素酶檢測試劑盒和抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體購自Abcam；DMEM 培養基購自Gibco；反轉錄試劑盒購于TaKaRa；抗SMAD2、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）和 p-SMAD2 抗體及辣根過氧化物酶標記的兔Ⅱ抗均購自碧云天生物技術研究所。

2 主要方法

2.1 細胞培養 NIH-3T3細胞在添加100 mg/L青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM 培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱培養。

2.2 細胞轉染 將NIH-3T3 細胞按照Lipofectami?neTM2000 試劑制造商規定的步驟分別轉染miR-NC和miR-433 mimic。轉染48 h后，用含2 μg/L TGF-β1的DMEM培養基培養細胞24 h。

2.3 雙螢光素酶報告基因實驗 利用TargetScan（http：//www.targetscan.org）預測 SMAD2 的 3'-UTR可能與miR-433 存在相結合的位點。SMAD2 野生型3'-UTR 螢光素酶報告基因質粒pMIR-SMAD2-wt 和突變型報告基因質粒pMIR-SMAD2-Mut 構建完成后，以NIH-3T3 細胞為對象進行細胞轉染實驗，分為pMIR-SMAD2-wt+miR-NC 組、pMIR-SMAD2-wt+miR-433 mimic 組、pMIR-SMAD2-Mut+miR-NC 組及 pMIRSMAD2-Mut+miR-433 mimic 組。轉染 24 h 后，使用雙螢光素酶檢測試劑盒檢測螢光素酶活性，以螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性的比值作為相對熒光素酶活性。

2.4 RT-qPCR 實驗 使用Trizol 從細胞中提取總RNA，采用反轉錄試劑盒合成cDNA，按照RT-qPCR試劑盒制造商執行標準進行PCR，miR-433 的表達水平以U6為內參照，SMAD2、FN、α-SMA和CTGF的mRNA表達水平以GAPDH為內參照，以2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。miR-433的上游引物序列為5'-TGCGGTACGGTGAGCCTGTC-3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6的上游引物序列為5'-CGCAAGGATGACACG-3'，下游引物序列為5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'；SMAD2的上游引物序列為5'-ACCGAAATGCCACGGTAGAA-3'，下游引物序列為5'-TGGGGCTCTGCACAAAGAT-3'；FN的上游引物序列為5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAAT?GG-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-CACTGAAGCAG?GTTTCCTCGGTTGT-3'；α-SMA的上游引物序列為5'-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3'，下游引物序列為 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3'；CTGF 的上游引物序列為5'-GCGAAGCTGACCTG?GAGGA-3'，下游引物序列為5'-CGCACGAGTGGTG?GTTCTGTGCG-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTTCC-3'，下游引物序列為5'-TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT-3'。

2.5 Western blot實驗 采用RIPA 裂解液提取細胞蛋白，遵照BCA法測定蛋白濃度，加入緩沖液后變性蛋白。每泳道加入50μg 蛋白，用12%SDS-PAGE 分離蛋白，然后將蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液37℃封閉1 h。加入I 抗［抗SMAD2、FN、α-SMA、CTGF 和 p-SMAD2 抗體（1∶500），抗 GAPDH 抗體（1∶1 000）］，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的兔Ⅱ抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。TBST 洗滌3 次，每次15 min。ECL 液暗室發光顯影，采集圖像并分析。

2.6 CCK-8法檢測細胞活力 NIH-3T3細胞按每孔1×104個接種于96 孔板，每孔200 μL 細胞懸液，分組培養后，按照CCK-8 試劑盒說明書，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育 1～2 h 后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）。

2.7 流式細胞術檢測細胞周期分布 預處理的NIH-3T3細胞用預冷的PBS重懸，將細胞懸液加入預冷的70%乙醇中固定，置于4℃過夜。去除乙醇后，加入100 μL RNase A，37℃水浴30 min，接著添加400μL PI 染色并混勻，4℃避光30 min，使用流式細胞術檢測細胞周期分布情況。

2.8 建立矽塵誘導的小鼠肺纖維化模型 將C57BL/6 小鼠分為假手術（sham）組、SiO2+miR-NC 組和 SiO2+miR-433 組，飼養于 20～23℃、40%～75% 濕度、12 h 光/暗周期條件下，自由獲取水和食物，小鼠常規飼養1 周后構建動物模型。使用0.2 mL 的1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，然后頸部去毛并消毒，首先用眼科剪剪開外層的皮膚，進行鈍性分離，輕柔逐層暴露氣管，進行氣管灌注：SiO2+miR-433組小鼠以200 nmol/kg agomiR-433和50 mg/kg矽塵并加入50μL生理鹽水；SiO2+miR-NC組小鼠以200 nmol/kg agomiR-NC 和 50 mg/kg 矽塵并加入 50 μL 生理鹽水；sham 組小鼠以等體積生理鹽水進行灌注。灌注后，迅速將各組小鼠直立并輕輕旋轉2 min，使溶液和生理鹽水盡可能均勻地分布于小鼠的左右肺內。待各組小鼠清醒后，進行常規飼養，然后每周尾靜脈注射120 nmol//kg agomiR-433 或agomiR-NC。造模28 d 后處死小鼠，取肺組織樣本，甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，采用HE 染色和Masson 染色對小鼠肺纖維化進行分析（從每張切片中選取3 個不重疊的視野圖片，計算膠原纖維染色的積分吸光度）。

2.9 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫處理水化組織切片，阻斷內源性過氧化物酶。切片使用預先配制好的檸檬酸緩沖液進行酸固定，然后使用微波加熱程序進行抗原修復，5%正常羊血清室溫封閉15 min，加抗α-SMA抗體（1∶100），4℃過夜；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ⅱ抗（1∶200）常溫孵育30 min；DAB 顯色后，蘇木精室溫染色2 min，脫水，中性樹脂封片，采用正置顯微鏡觀察。

3 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-433與SMAD2的靶向調控關系

采用TargetScan 軟件預測miR-433 潛在的靶基因，結果顯示，miR-433 在 SMAD2 的 3'-UTR 上有潛在的結合位點，見圖1A。雙螢光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-433 mimic能明顯抑制SMAD2野生型3'-UTR 螢光素酶報告基因質粒pMIR-SMAD2-wt 的螢光素酶活性，而對SMAD2 突變型報告基因質粒pMIR-SMAD2-Mut的螢光素酶活性無明顯影響，見圖1B。Western blot 檢測結果顯示，轉染miR-433 mimic能抑制SMAD2 蛋白的表達（P＜0.01），見圖1C，同時SMAD2 的mRNA 表達水平較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖 1D。上述結果表明，miR-433 能與SMAD2的3'-UTR結合并抑制SMAD2的表達水平。

2 TGF-β1對NIH-3T3細胞miR-433表達的影響

與對照組相比，TGF-β1 處理 NIH-3T3 細胞后，miR-433的表達水平明顯降低（P＜0.01），見圖2A；而NIH-3T3 細胞轉染 miR-433 mimic 后，miR-433 的表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖2B。

3 miR-433對NIH-3T3細胞相關蛋白表達的影響

Western blot 和 RT-qPCR 結果顯示，TGF-β1 刺激能明顯上調NIH-3T3 細胞p-SMAD2 蛋白水平，同時 FN、α-SMA 和 CTGF 蛋白和 mRNA 的表達較對照組也明顯升高（P＜0.01），而轉染miR-433 mimic 能逆轉 TGF-β1 對 NIH-3T3 細胞 FN、α-SMA 和 CTGF 蛋白及mRNA 表達的作用，同時抑制TGF-β1 信號通路中關鍵信號分子SMAD2 蛋白的磷酸化（P＜0.01）。上述結果提示 miR-433 可抑制TGF-β1/SMAD2 信號通路的活化。

4 miR-433對NIH-3T3細胞活力和周期的影響

Figure 1.Targeting relationship between miR-433 and SMAD2.A：the target gene of miR-433 was predicted by software；B：the re?sults of dual-luciferase reporter assay；C：RT-qPCR was used to detect the expression of SMAD2 mRNA in NIH-3T3 cells；D：the protein expression of SMAD2 in NIH-3T3 cells was detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs miR-NC group.圖1 miR-433與SMAD2的靶向調控關系

Figure 2.The expression of miR-433 in the NIH-3T3 cells treated with TGF-β1.A：the expression level of miR-433 was detected by RT-qPCR after the NIH-3T3 cells were treated with TGF-β1；B：the expression level of miR-433 in the NIH-3T3 cells transfected with miR-433 mimic was detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 TGF-β1處理NIH-3T3細胞后miR-433表達的變化

采用CCK-8 法檢測上述3 組NIH-3T3 細胞的活力，結果顯示，TGF-β1+miR-NC 處理組細胞的活力較對照組明顯升高（P＜0.01），而轉染miR-433 mimic能逆轉TGF-β1 對細胞活力的影響（P＜0.05），見圖4A。采用流式細胞術檢測各組細胞周期的分布，結果顯示，與對照組相比，TGF-β1能增加處于S期的細胞數量，而miR-433 過表達能逆轉TGF-β1 誘導的S期阻滯（P＜0.01），見圖4B。上述結果表明miR-433能抑制 TGF-β1 誘導的 NIH-3T3 細胞生長及 S 期阻滯。

Figure 3.The effect of miR-433 on the protein（A）and mRNA（B）expression of fibrosis-releted molecules in NIH-3T3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TGF-β1+miR-NC group.圖3 miR-433對成纖維細胞相關蛋白的影響

Figure 4.The effect of miR-433 on the viability（A）and cell cy?cle distribution（B）of NIH-3T3 cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs TGF-β1+miR-NC group.圖4 miR-433對NIH-3T3細胞活力和周期分布的影響

5 miR-433對小鼠肺纖維化的影響

為觀察miR-433 對小鼠肺纖維化的影響，采用agomiR-433 對矽塵誘導小鼠肺纖維化模型進行干預。HE 染色結果顯示，與sham 組相比，SiO2+miRNC 組的肺纖維化程度加重，而SiO2+miR-433 組的肺纖維化面積較SiO2+miR-NC 組明顯降低，病變較輕；同時，Masson染色結果也顯示，SiO2+miR-NC組中有大量的藍色膠原沉積，而SiO2+miR-433 組中膠原沉積明顯減少（P＜0.01），見圖5。采用免疫組化檢測小鼠肺組織中纖維化標志物α-SMA 的表達水平，結果顯示，SiO2+miR-NC 組中α-SMA 的表達明顯高于sham組，而SiO2+miR-433組中α-SMA的表達較SiO2+miR-NC 組明顯降低（P＜0.01），見圖6。上述結果均表明，過表達miR-433 能減輕矽塵誘導的小鼠肺纖維化，提示miR-433可能具有抗肺纖維化作用。

討 論

吸入結晶性SiO2引起的矽肺病是一種慢性進行性肺部纖維化疾病［8］。越來越多的證據表明，SiO2顆粒會激活巨噬細胞和上皮細胞，從而釋放出氧化型氧化劑和細胞因子，進而導致成纖維細胞增殖，上皮-間質轉化，細胞外基質沉積，并最終導致纖維化（矽肺）［9］。盡管矽肺的致病因素很明確，但矽肺的復雜生物學和分子機制尚未得到充分闡明。

近幾年，miRNAs 在肺纖維化中的潛在作用被提出，Wu 等［10］研究發現 miR-489 可通過靶向 MyD88和 SMAD3 抑制二氧化硅誘導的肺纖維化，Ji 等［11］發現 ，miR-21、miR-455、miR-151-3p、miR-486-5p 和miR-3107等5種miRNA 在肺纖維化小鼠模型中表達失調。在本研究中，通過TargetScan 軟件預測SMAD2為miR-433 的潛在靶基因，隨后使用雙螢光素酶報告基因、Western blot 等多項實驗進行驗證。結果表明，miR-433能特異性結合SMAD2的3'-UTR，并抑制其蛋白和mRNA 的表達，這些結果證明了SMAD2是miR-433的靶基因。

Figure 5.HE staining and Masson staining results of pulmonary fibrosis in mice（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs SiO2+miR-NC group.圖5 小鼠肺組織HE染色和Masson染色結果

Figure 6.The expression of α-SMA in the lung tissue of the mice（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs SiO2+miR-NC group.圖6 免疫組化檢測小鼠肺組織中α-SMA的表達

TGF-β1 是重要的促纖維化細胞因子，已有研究證明TGF-β1 在肺纖維化患者和動物的肺組織中高表達［12-13］。同時在肺纖維化過程中，miR-21、miR-155、miR-154等都受TGF-β1的調控［14］。本研究發現SMAD2受miR-433的靶向調控，而SMAD2是TGF-β1信號轉導通路的主要效應分子［15-16］，因此，我們推測miR-433 與TGF-β1 存在相互作用。在本研究中，我們使用 TGF-β1 處理 NIH-3T3 細胞后發現，miR-433的表達水平明顯降低，提示miR-433 表達水平的變化可能與TGF-β1有關。為進一步研究miR-433在纖維化中對TGF-β1/SMAD 信號通路的影響，我們將miR-NC和miR-433 mimic分別轉染進NIH-3T3細胞，發現 TGF-β1 處理轉染 miR-NC 細胞后，p-SMAD2 蛋白明顯升高，并且 FN、α-SMA 和CTGF 蛋白和mRNA的表達也明顯高于對照組。同時，體外細胞實驗結果顯示TGF-β1 能誘導轉染miR-NC 細胞的活力和S期細胞數量明顯增加。但在轉染miR-433 mimic 細胞中，TGF-β1 的這些促纖維化效果會因miR-433 的過表達而被逆轉。這些結果提示，miR-433能通過抑制TGF-β1/SMAD信號通路發揮抗纖維化的作用。

在本研究中，我們首先采用agomiR-433 對矽塵誘導小鼠肺纖維化模型進行干預，并通過HE染色及Masson 染色發現過表達miR-433 能減少肺纖維化面積，抑制矽塵誘導的小鼠肺纖維化進程。肌成纖維細胞是造成細胞外基質沉積的主要細胞，肌成纖維細胞出現是肺纖維化過程中的關鍵步驟［17］。而α-SMA 則是肌成纖維細胞特異的標志蛋白，是研究肌成纖維細胞活化的關鍵性蛋白［18］。我們進一步通過免疫組化實驗發現采用agomiR-433干預能明顯降低小鼠肺組織中α-SMA 的表達水平，這些結果均提示miR-433可能具有抗肺纖維化作用。

綜上所述，本研究實驗結果表明miR-433 能減輕矽塵誘導的小鼠肺纖維化，且miR-433 可能通過靶向調控SMAD2抑制TGF-β1/SMAD信號通路，從而參與調節纖維化的進程。