TLR4介導可溶性尿酸誘導的腎小管上皮細胞自噬流異常*

易 揚，陳 緣，蔣遠霞，楊海波△，謝愷慶△

（廣西醫科大學 1第二附屬醫院腎內科，2微生物學教研室，廣西南寧530021）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是一類危害全球人類健康的重大疾病。高尿酸血癥是CKD 的常見并發癥之一，是CKD 進行性發展及預后的獨立危險因素［1］。當CKD 3～5 期的患者伴有高尿酸血癥時，腎功能快速進展且達到腎替代治療的風險顯著增高［2-3］。在人體循環中，尿酸（uric acid，UA）通常以弱酸的形式溶于細胞內，在細胞內pKa為5.8、pH 為7.40 的情況下，98%的尿酸以可溶性尿酸的形式釋放于細胞外。相關文獻表明，可溶性尿酸可引起腎小管上皮細胞慢性損傷及腎間質炎癥，導致腎質纖維化加重，加速了CKD 的發展進程［4］。自噬是一種細胞回收過程，涉及自我降解和重建受損的細胞器及蛋白質，目前的證據表明自噬在腎臟疾病的病理生理過程中發揮至關重要的作用［5-6］。最新研究表明，病原相關分子模式外源性分子和內源性損傷相關分子模式可激活Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）信號轉導途徑而誘發炎癥反應，同時TLR4 信號通路也可介導自噬異常。我們前期及前人研究發現，自噬參與調控可溶性尿酸誘導的腎小管炎癥反應［7-9］。本研究設計體外干預實驗，探討TLR4 與可溶性尿酸誘導腎小管上皮細胞自噬的關系，為臨床延緩或防治CKD進展提供理論依據。

材料和方法

1 細胞株

人近端腎小管上皮細胞株HK-2購自ATCC。

2 主要試劑和儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和低糖DMEM 培養基（GIBCO）；氯喹（chloroquine，CQ）和尿酸（Sigma）；兔抗人P62單克隆抗體和兔抗人LC3B單克隆抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗人TLR4多克隆抗體（Abcam）；TLR4抑制劑TAK242（MCE）；Western blot 實驗相關試劑（索萊寶）；自噬雙標腺病毒mRFP-GTP-LC3（上海漢恒生物）。CO2培養箱（Thermo Scientific）；垂直電泳-轉膜裝置（Bio-Rad）。

3 方法

3.1 尿酸和自噬干預劑及正常對照試劑的制備0.5 g 尿酸和少許雙蒸水制成混懸液，用1 mol/L NaOH 滴定至澄清，再用雙蒸水補足至10 mL，制成50 g/L 的溶液，經過0.22μm 濾膜除菌備用。將配制可溶性尿酸等量的NaOH 加入雙蒸水補足至10 mL，配成NaOH 溶液作為對照組的試劑。可溶性尿酸在干預之前用偏光顯微鏡檢測沒有尿酸晶體，在細胞培養的過程中也沒有發現尿酸結晶。自噬干預劑氯喹按照說明書方法制備成溶液備用。

3.2 HK-2 細胞的培養和分組 HK-2 細胞于37℃、5% CO2條件下，用含10% FBS 及1%雙抗的低糖DMEM 培養基培養。HK-2 細胞經0.25%胰蛋白酶消化液消化后，用含10% FBS 低糖DMEM 培養液重懸，以每孔 1×105細胞數接種于 6 孔板中，置 37℃、5% CO2條件下培養。細胞隨機分為以下4 組：正常對照（control）組、UA（120 mg/L）組、CQ（10 μmol/L）組和UA（120 mg/L）+CQ（10μmol/L）組，各藥物作用HK-2 細胞 12 h。在使用 TLR4 抑制劑 TAK242 的實驗中設對照組、UA（120 mg/L）組和TAK242（1μmol/L）+UA（120 mg/L）組，分別刺激 HK-2 細胞4 h 和24 h。經pH 檢測儀檢測各實驗組與對照組培養液pH值，各組細胞培養環境的pH 值保持在6.5～7.0 范圍內。

3.3 Western blot 檢測蛋白表達 根據RIPA Lysis Buffer說明書提取HK-2細胞總蛋白，SDS-PAGE分離后切取目的條帶進行轉膜。轉膜結束后，用封閉液室溫封閉1 h。將封閉好的PVDF 膜使用TBST 洗3次，每次5 min，加入Ⅰ抗［抗LC3B、P62 和TLR4 抗體（1∶500），抗GAPDH 抗體（1∶1 000）］，在4℃側擺搖床上緩慢搖動孵育過夜，TBST 洗3 次，每次5 min。之后PVDF膜加入稀釋好的Ⅱ抗，搖床上緩慢搖動孵育 1 h 后用 PBST 洗滌 3 次，最后采用 Odyssey 紅外熒光掃描成像系統分析。條帶經掃描后，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics）進行灰度值計算分析。

3.4 透射電鏡觀察細胞內自噬小體的數量 將HK-2 細胞接種于6 孔板之中培養，按照上述分組對細胞進行干預。用含有EDTA 的胰酶進行消化，3～5 min 后觀察到細胞變圓或部分脫壁后，反復輕柔吹打，盡可能使全部的貼壁細胞混懸，巴氏吸管將細胞懸液轉移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清；將3%的戊二醛溶液加入離心管中，加入量必須沒過細胞沉淀，將離心管放置于4℃冰箱內固定2 h 以上；固定好的標本送電鏡室進行包埋、超薄切片后置于透射電子顯微鏡下觀察細胞內自噬體的變化并拍照記錄。

3.5 自噬雙標腺病毒實驗觀察細胞內自噬流 將HK-2 細胞接種于共聚焦培養皿中，待細胞鋪滿50%時采用自噬雙標腺病毒轉染細胞，按照說明書觀察細胞轉染情況并對細胞進行換液。24～36 h 后按照上述分組進行干預，在共聚焦顯微鏡下觀察。每孔取5 個視野觀察并拍照。mRFP-GFP-LC3 雙標腺病毒中表達的GFP 和mRFP 熒光蛋白用于標記及追蹤LC3，最后將處理好的標本在共聚焦顯微鏡下觀察成像并拍照記錄，紅、綠熒光合并后可觀察到黃色斑點及紅色斑點，黃色斑點為自噬體，紅色斑點為自噬溶酶體。

3.6 RT-qPCR 檢測 TLR4 在 HK-2 細胞中的 mRNA表達 提取各組細胞總RNA，分光光度計測定總RNA 的含量及濃度，將RNA 逆轉錄為cDNA，然后進行 PCR 擴增。 TLR4 的上游引物序列為 5′-CAGAGTTTCCTGCAATGGATCA-3′，下游引物序列為5′-GCTTATCTGAAGGTGTTGCACAT-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGA?AC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGAAGACGCCAGT?GGA-3′。反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

4 統計學處理

應用SPSS 22.0軟件進行統計分析。實驗重復3次，數據以均數±標準差（mean±SD）表示，經正態性檢驗，所有定量變量符合正態分布。多組均數的比較用單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 可溶性尿酸刺激HK-2細胞自噬相關蛋白的表達

Figure 1.The protein expression of LC3-Ⅱ and P62 was detected by Western blot.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；##P＜0.01 vs UA group；△△P＜0.01 vs CQ group.圖1 HK-2細胞內自噬相關蛋白的表達

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細胞12 h 后，Western blot 結果表明，與對照組相比，UA 組 LC3-Ⅱ和 P62 的蛋白表達增加（P＜0.05）；與 UA 組相比，UA+CQ 組LC3-Ⅱ和P62 的蛋白表達進一步增加（P＜0.01），見圖1。

2 透射電鏡觀察可溶性尿酸刺激的HK-2細胞內自噬小體

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細胞12 h 后，透射電鏡下可看到UA 組HK-2細胞的胞質中較對照組出現較多自噬體（圖2 白色箭頭所示），其內包含著未消化的胞漿成分或細胞器，而自噬溶酶體少見，見圖2。

3 TAK242 對可溶性尿酸刺激HK-2 細胞自噬相關蛋白表達水平的影響

Figure 2.Autophagyosomes in the HK-2 cells（×500）.圖2 HK-2細胞內的自噬體

可溶性尿酸（120 mg/L）刺激 HK-2 細胞 4 h 后，RT-qPCR 結果表明，與對照組相比，UA 組 TLR4 的mRNA 表達增高（P＜0.05），而TAK242抑制可溶性尿酸刺激HK-2 細胞TLR4 的 mRNA 表達（P＜0.05），見圖3A。可溶性尿酸刺激HK-2 細胞24 h 后Western blot結果表明，與對照組相比，UA 組 LC3-Ⅱ和 P62 的蛋白表達增高（P＜0.05）；而與 UA 組相比，UA+TAK242 組的 LC3-Ⅱ和 P62 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3.The effects of TLR4 inhibitor TAK242 on the expression of TLR4，LC3-Ⅱ and P62.A：the mRNA expression of TLR4；B：the protein expression of TLR4，LC3-Ⅱ and P62.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs UA group.圖3 TLR4抑制劑TAK242對TLR4、LC3-Ⅱ和P62表達的影響

4 TAK242 對可溶性尿酸刺激HK-2 細胞自噬流的影響

自噬雙標腺病毒實驗結果顯示，與對照組相比，可溶性尿酸（120 mg/L）刺激HK-2 細胞24 h 后，圖像中黃色斑點（圖4A 白色箭頭所示）顯著增多，且黃色斑點多于紅色斑點（圖4A 藍色色箭頭所示），即自噬小體顯著增多，且自噬溶酶體較少；而與UA 組相比，TAK242+UA 組圖像中黃色斑點減少，紅色斑點相對增多（P＜0.05），即TAK242+UA 組自噬小體減少，自噬溶酶體相對增多，表明自噬小體與溶酶體融合現象增多，形成自噬溶酶體的進程更順暢，見圖4。

討 論

Figure 4.Changes of autophagy in HK-2 cells transfected with mRFP-GFP-LC3.A：the autophagic flux was observed by mRFP-GFPLC3（×600；arrows indicate different color dots within the cells；the yellow dots indicate autophagosomes，while the red dots indicate autophagolysosomes in merged images）；B：numbers of green and red dots per cell；C：numbers of autophago?somes（yellow dots in merged images）and autophagolysosomes（red dots in merged images）per cell.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs UA group.圖4 mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染后HK-2細胞內自噬情況的變化

高尿酸血癥是CKD 的常見并發癥之一，人體尿酸以可溶性尿酸及尿酸鹽結晶兩種形式存在。既往認為，高濃度尿酸鹽或尿酸在適宜條件下析出結晶沉積于腎小管間質引發癥性反應是高尿酸血癥致腎損害的主要發病機制。許多并發高尿酸血癥的慢性腎臟疾病，其腎臟病理組織中尿酸鹽或尿酸結晶僅少量沉積于腎臟某些局部，甚至不能發現，而慢性尿酸腎病卻為彌漫性腎小管間質病變及腎小動脈硬化，用尿酸鹽結晶致病機制無法解釋此現象［3，10］。自噬是一種高度保守的分解代謝過程，用于清除細胞質組分，包括蛋白質聚集物和受損的細胞器。自噬的作用不僅是降解產物，它還是一個動態的回收系統，為細胞修復和動態平衡產生新的蛋白和能量。相關研究表明，自噬與腎臟的固有細胞，如足細胞、系膜細胞、內皮細胞和腎小管上皮細胞密切相關［11-12］。腎損傷時自噬可防止腎臟的損傷；相反，過度的激活和功能受損的自噬過程可導致細胞死亡，加快疾病的發展和惡化［13］。LC3 是酵母 Atg8 蛋白的哺乳動物同源物，在受到半胱氨酸蛋白酶催化后，LC3 的C 端甘氨酸基團暴露而形成LC3-I，其在自噬相關蛋白的作用下形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ始終穩定結合在自噬體膜表面上，直到與溶酶體融合。當自噬增強時，細胞內LC3-I 向LC3-Ⅱ轉化增加，從而使得LC3-Ⅱ/LC3-I 比值增加，故LC3-Ⅱ的含量在一定的程度上反映了細胞的自噬水平［14］。定位于自噬體內膜的LC3-Ⅱ和自噬體內容物一起與溶酶體相互融合后，在溶酶體內消化酶的作用下降解。當氯喹干擾溶酶體內pH 值使得消化酶活性降低時，則會使得自噬溶酶體降解能力下降，從而引起LC3-Ⅱ水平增加。然而，相關研究顯示，當LC3-Ⅱ在自噬體內堆積時，P62 水平也會相應的增多，當LC3-Ⅱ升高，P62 水平降低，表示自噬流通暢，溶酶體和自噬小體融合后降解；當LC3-Ⅱ和P62 水平同時升高時，表明自噬啟動正常，但下游自噬流不通暢，溶酶體和自噬小體不能融合形成自噬溶酶體，導致自噬小體蓄積在細胞內［15］。本實驗使用可溶性尿酸刺激HK-2 細胞后，LC3-Ⅱ、P62表達上調，加入氯喹刺激后，可以觀察到LC3-Ⅱ和P62 的水平進一步表達增加，透射電子顯微鏡下觀察到自噬小體增多，自噬溶酶體少見，結果提示可溶性尿酸誘導腎小管上皮細胞自噬，但自噬流下游不通暢。

TLR4 調控早期自噬的研究使科研人員將自噬與天然免疫聯系起來，他們認為這是宿主對多種細胞內病原體的防御反應［16］。在感染過程中自噬的調節是復雜的，由許多受體介導，TLR4 可識別病原體的特定分子模式，在天然免疫和適應性免疫中起著重要作用［17］。研究已證實，腎損傷時TLR4既可以激活依賴MyD88 信號通路也可激活非MyD88 依賴的信號通路調控自噬過程［10，18-19］。近年來 TLR4 調控自噬在腎臟疾病中的作用已經受到研究者的廣泛關注，但現有的資料顯示具體機制尚無確切定論。在不同原因導致的急慢性腎損傷中都有研究報道顯示TLR4 激活自噬對腎損傷發揮保護作用；然而在順鉑導致的腎損傷模型中，TLR4 可介導自噬異常從而加劇腎小管損傷并對腎臟功能造成影響。本實驗結果證實，TAK242 可明顯降低可溶性尿酸的誘導腎小管上皮細胞TLR4、LC3-Ⅱ和P62 的表達水平，提示TLR4 可參與調控可溶性尿酸誘導腎小管上皮細胞的自噬。自噬雙標腺病毒結果表明可溶性尿酸組自噬小體和自噬溶酶體增多，且自噬小體顯著多于自噬溶酶體，提示自噬增強，但自噬流不通暢；而加入TAK242 則可增加HK-2 細胞的自噬小體與溶酶體融合，緩解自噬流不通暢現象。綜上所述，我們的研究結果表明，可溶性尿酸可誘導腎小管上皮細胞自噬，但自噬流不通暢；同時，可溶性尿酸可通過TLR4 介導腎小管上皮細胞自噬流異常。