紫檀芪對宮頸癌細胞自噬及SIRT1-FoxO信號通路的影響*

鐘桂蘭，周 知，王 茹，符山花，劉曉芳

［1海南省婦幼保健院（海南省婦女兒童醫學中心）婦科，海南?？?72600；2黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040］

隨著對細胞自噬的深入研究，人們越發認識到自噬在腫瘤發生發展過程中起著重要作用，一方面自噬發揮保護細胞的作用，實現細胞器更新和代謝需求，另一方面自噬可作為Ⅱ型細胞程序性死亡，誘導細胞凋亡，因此研究自噬發生機制有利于臨床宮頸癌的治療［1-2］。有研究顯示，sirtuin 1（SIRT1）不僅可通過叉頭框蛋白O（forkhead box protein O，FoxO）調控自噬，也可調控氧化應激，參與細胞凋亡、增殖等過程［3-4］，SIRT1-FoxO 信號通路有可能成為臨床上治療宮頸癌的新靶點。紫檀芪（pterostilbene，PTE）類屬于藜蘆醇同系物，具有抗腫瘤和激活細胞自噬的作用［5］，但PTE激活自噬的具體作用機制未見相關報道。因此，本研究通過觀察PTE 對人宮頸癌HeLa細胞自噬的影響，探究其相關作用機制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

PTE（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，貨號：B21702-20 mg；DMEM、CCK-8 試劑盒、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RIPA 細胞裂解液和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液購自碧云天生物技術研究所；BCA 蛋白定量試劑盒和PVDF 膜購自上海炎熙生物科技有限公司；兔抗人p62、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和 β-actin 抗體均購自上海熹垣生物科技有限公司；兔抗人SIRT1 和FoxO抗體和羊抗兔IgG-HRP均購自上海恒斐生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購自上海群己生物科技有限公司。

SpectraMax M3 型多功能酶標儀購自MD；Attune NxT型流式細胞儀和iBright FL1500型智能成像系統均購自Thermo Fisher Scientific；LVEM5 型臺式透射電子顯微鏡購自Delong Instruments。

2 細胞培養及分組

人宮頸癌細胞株HeLa 購自中科院上海細胞庫。培養液為含10% FBS 和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養液，在37℃、5% CO2、相對濕度98%的恒溫培養箱中培養。隔天換液，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗，根據CCK-8 實驗測出PTE 對 HeLa 細胞的 IC50，以 IC50為 PTE 最大作用濃度進行分組，分別為0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L 和60μmol/L PTE組，再開展后續實驗。

3 方法

3.1 CCK-8 法測定PTE 對HeLa 細胞活力的影響收集對數生長期HeLa 細胞，用含有FBS 的DMEM 培養液調整細胞密度，按照每孔8×103個的數量接種至96孔板中。繼續培養12 h，棄去舊DMEM 培養液，加入200μL 含有不同濃度PTE（PTE 終濃度分別為0、2、5、10、20、40 和 80 μmol/L）的 DMEM 培養液［6］，培養 24 h 和 48 h 后，棄去舊 DMEM 培養液，各孔加入180μL DMEM 培養液和20μL CCK-8 溶液。繼續培養2 h后棄舊培養液，用多功能酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A），同時設置空白對照組和0.1%DMSO 對照組，每個濃度設置6 個復孔。細胞活力抑制率（%）=［1-（實驗組A值-空白對照A值）/（對照組A值-空白對照A值）］×100%。用SPSS軟件計算PTE對HeLa細胞的半數抑制濃度（IC50）。

3.2 流式細胞儀測定PTE 對HeLa 細胞凋亡率的影響 收集對數生長期HeLa 細胞，用含有FBS 的DMEM 培養液調整細胞密度，按照每孔2.0×105個的密度接種到6孔板上，繼續培養12 h，棄去舊培養液，加終濃度含有 0、15、30 和 60 μmol/L PTE 的 DMEM培養液，培養48 h 后，棄去舊DMEM 培養液，避光條件下加入FITC 和PI，標記細胞，具體操作按照An?nexin V-FITC/PI 試劑盒說明書進行，每個濃度設置6個復孔，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

3.3 透射電鏡觀察PTE 處理后HeLa 細胞中自噬體 HeLa 細胞經0 μmol/L、15 μmol/L、30 μmol/L 和60 μmol/L PTE 處理48 h 后，用胰酶消化，離心后，用預冷的PBS 重懸細胞，離心、棄上清液，2.5%戊二醛固定15 min，脫水、包埋、切片，枸櫞酸鉛染色，用透射電鏡觀察HeLa細胞中自噬體。

3.4 qPCR 測定 PTE 處理 后 HeLa 細 胞中 SIRT1 和FoxO 的mRNA 表達 采用Trizol 法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以其為模板進行qPCR，用GAPDH 為內參照。GAPDH 上游引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，下游引物序列為5'-TGCACCACCAACTGTTAGC-3'；SIRT1 上游引物序列為5'-AGGCGGATTTCTGAGTTCGA-3'，下游引物序列為5'-CGTCCCTTGTAATGTTTCCC-3'；FoxO上游引物序列為5'-CTCATCACCAAGGCCATCGAG-3'，下 游 引 物 序 列 為 5'-CCATGGACG?CAGCTCTTCTC-3'。按試劑盒說明建立終體積為20μL 的反應體系：2 μL 反轉錄產物，10 μL SYBR Green Mix，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，7μL ddH2O。熱循環參數為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，40 個循環。結果采用2-ΔΔCt法進行計算。

3.5 Western blot 法測定 PTE 處理后 HeLa 細胞中SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax和Bcl-2水平用RIPA 細胞裂解液裂解經PTE 處理后的HeLa 細胞，4℃離心提取總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量，操作按照試劑盒說明書進行。SDSPAGE 分離目標蛋白（低壓80 V，30 min；高壓120 V，60 min），轉至PVDF 膜上，5% BSA 封閉，分別加入相應兔抗人SIRT1、FoxO、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Bax、Bcl-2 和β-actin I 抗（1∶1 000），孵育過夜，加入羊抗兔IgG-HRP II 抗（1∶2 000），孵育2 h，ECL 顯色，測定各蛋白條帶灰度值，蛋白相對含量=目標蛋白灰度值/內參照β-actin蛋白灰度值。

4 統計學處理

使用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差（mean±SD）形式表示。多組比較行單因素方差分析，任意兩組相比行SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 PTE對HeLa細胞活力的影響

CCK-8 法結果顯示，PTE 作用于 HeLa 細胞 48 h后，細胞活力受到抑制，活力抑制率隨濃度增加而升高，具有濃度依賴性，見表1。PTE 對HeLa 細胞作用24 h 的 IC50為（53.87±5.48）μmol/L，48 h 的 IC50為（32.46±3.76）μmol/L，參照IC50值，后續實驗采用0、15、30和60μmol/L PTE進行。

表1 不同濃度PTE對HeLa細胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of PTE on the via?bility of HeLa cells（Mean±SD. n=6）

2 PTE促進HeLa細胞凋亡

為驗證PTE 促進HeLa 細胞凋亡，采用流式細胞術測定不同濃度PTE 對HeLa 細胞凋亡率的影響，與0 μmol/L PTE 相比，15、30和60 μmol/L PTE 處理后，HeLa 細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.The effect of different concentrations of PTE on the apoptosis rate of HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15μmol/L PTE；△P＜0.05 vs 30μmol/L PTE group.圖1 不同濃度PTE對HeLa細胞凋亡率的影響

3 PTE增加HeLa細胞中自噬體數目

通過透射電鏡觀察到，無PTE（0 μmol/L PTE）處理的HeLa 細胞中自噬體數目較少，經15、30 和60μmol/L PTE 處理后，HeLa細胞中自噬體數目明顯增加，見圖2。

4 PTE 處理后 HeLa 細胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62水平比較

為進一步確定PTE 處理對HeLa 細胞自噬和凋亡的作用，不同濃度PTE處理后，通過Western blot法測定相關蛋白表達，結果顯示，與0 μmol/L PTE 相比，15、30和60μmol/L PTE處理后，HeLa細胞中Bax和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著升高（P＜0.05），Bcl-2 和p62 水平顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖3。

Figure 2.Comparison of the number of autophagosomes in HeLa cells after PTE treatment（lead citrate staining，scale bar=1 or 2 μm）.The autophagosome are indicated by black arrow.圖2 PTE處理后HeLa細胞中自噬體數目比較

Figure 3.Western blot was used to detect the protein levels of Bcl-2，Bax，LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ and p62 in HeLa cells.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 μmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30μmol/L PTE group.圖3 Western blot 法檢測 HeLa 細胞中 Bcl-2、Bax、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62蛋白水平

5 PTE 處 理 后 HeLa 細 胞 中 SIRT1 和 FoxO 的mRNA及蛋白表達

為研究 PTE 處理對 HeLa 細胞 SIRT1/FoxO 通路的影響，不同濃度PTE處理后，通過Western blot法測定相關蛋白表達，結果顯示，與0 μmol/L PTE 相比，經 15、30 和 60 μmol/L PTE 處理后，HeLa 細胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05），見圖4。

討 論

Figure 4．Expression of SIRT1 and FoxO in HeLa cells after PTE treatment.A：the mRNA expression of SIRT1 and FoxO detected by qPCR；B：the protein expres?sion of SIRT1 and FoxO detected by Western blot.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 μmol/L PTE group；#P＜0.05 vs 15 μmol/L PTE group；△P＜0.05 vs 30.0μmol/L PTE group.圖 4 PTE 處理 后 HeLa 細 胞中 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表達

宮頸癌發病率和病死率逐年升高，全球每年新增患者近50萬人［7］，近年來，自噬在腫瘤進程的作用受到越來越多研究者們的關注，有望成為腫瘤治療中促進腫瘤細胞凋亡的新靶點。PTE 是主要從葡萄和藍莓中提取而來的天然化合物，是一種天然的抗氧化劑。最新研究顯示，PTE生物活性廣泛，具有顯著的抗腫瘤活性；研究顯示，PTE可激活人視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1細胞自噬，抑制其增殖，促進其凋亡［8］。劉盛楠等［9］研究顯示 PTE 通過上調 Bax、Fas、細胞色素C和caspase-3，下調Bcl-2，抑制HepG2細胞增殖并促進其發生凋亡。本研究觀察到，經不同濃度PTE 處理后，HeLa 細胞活力抑制率、細胞凋亡率依次升高，提示PTE 可以抑制HeLa 細胞活力，促進細胞凋亡。細胞凋亡是細胞程序性死亡進程，主要受抑凋亡因子Bcl-2 和促凋亡因子Bax 調控，本研究進一步研究結果顯示，PTE 處理后，HeLa 細胞中Bcl-2 水平降低，Bax 水平升高，提示 PTE 通過上調 Bax、下調Bcl-2而抑制HeLa細胞增殖，促進其凋亡。

自噬與腫瘤細胞凋亡密切相關，研究顯示，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導因子誘導劑TIC10 聯合阿司匹林，可通過促進自噬，促進宮頸癌細胞凋亡［10］。LC3 由LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩個亞型組成，細胞發生自噬時，LC3-Ⅰ經加工形成LC3-Ⅱ，而p62 蛋白首先與泛素化的蛋白質結合，隨后與LC3-Ⅱ結合形成復合物，從而被降解，因此LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白水平常用來檢測細胞是否發生自噬［11-12］。研究顯示，PTE可通過上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平，促進人口腔癌細胞自噬，以抑制其增殖，促進其凋亡［13］。本研究觀察到，經PTE 處理后，HeLa 細胞中自噬體數目增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高，p62 水平降低，說明 PTE 可促進HeLa 細胞發生自噬，并通過此機制促進細胞凋亡，但是PTE 通過調控何種信號通路誘導HeLa 細胞自噬還有待進一步研究。

FoxO 主要由 FoxO1 和 FoxO3 組成，對腫瘤細胞增殖和凋亡具有重要的調控作用。研究顯示，FoxO3 高表達可促進結腸癌細胞凋亡［14］。SIRT1 是FoxO3 的上游通路，可調控 FoxO3 水平，SIRT1 活化劑激活FOXO1 的脫乙酰作用后，可刺激人皮膚成纖維細胞發生自噬［15］。此外研究顯示，PTE 可通過激活SIRT1/FoxO1信號通路，避免人臍靜脈內皮細胞再灌注損傷［16］。本研究觀察到，PTE處理后，HeLa細胞中SIRT1 和FoxO 的mRNA 及蛋白水平升高，說明PTE 調控細胞 SIRT1 和 FoxO 的 mRNA 及蛋白表達，推測PTE通過調控SIRT1-FoxO通路，調控自噬、凋亡相關因子表達，從而促進細胞自噬和凋亡

綜上所述，PTE 可通過激活SIRT1-FoxO 通路抑制HeLa 細胞增殖，促進細胞自噬、凋亡。然而PTE作用后誘導的自噬與凋亡之間是否有關聯，以及PTE在體內治療的作用有待進一步實驗驗證。