藁本內酯通過降低VEGF的水平抑制人血管瘤內皮細胞的血管新生和上皮-間充質轉化*

陳春蘭，張運君，許和平，鄭少顏

（海南省人民醫院全科醫學科，海南海口570100）

血管瘤是嬰幼兒最常見的血管源性皮膚腫瘤，具有迅速增殖后自發消退的特性［1］。大多數血管瘤是良性的，不對嬰兒構成嚴重威脅或產生并發癥，但是，少量血管瘤的高速生長或侵襲，可導致組織或器官損傷，并在某些情況下威脅生命［2］。目前，血管瘤的發病機制尚未完全清楚，但血管瘤內皮細胞的非控性增生是引發血管瘤的重要因素［3］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管內皮細胞增殖與血管新生等作用，被認為與血管瘤有著重要的聯系［4-5］。藁本內酯（ligustilide）又名3-丁烯基-4，5-二氫-1（3H）-異苯并呋喃酮，是我國傳統中藥傘形科植物當歸揮發油的主要活性成分。研究顯示，藁本內酯在舒張血管、抗血小板凝聚、抗炎等方面有生物學活性作用，同時藁本內酯對乳腺癌、肺癌等腫瘤具有抑制作用［6-8］。雖然尚未見到藁本內酯作用于血管瘤的研究及機制的報道，但可根據上述研究預測藁本內酯對其可能具有抑制作用。本研究旨在探討藁本內酯對人血管瘤內皮細胞（human hemangioendothelial cells，HemECs）增殖與血管新生的影響，并分析其機制。

材料和方法

1 材料和試劑

HemECs 購自上海澤葉生物公司。用EGM-2MV培養基培養于37℃、5% CO2的培養箱中，隔天換液，細胞融合率達到85%時進行傳代培養。藁本內酯購自成都曼思特生物科技有限公司；EGM-2MV培養基購自Lonza；Matrigel 購自BD；EdU 細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博公司；TRIzol 試劑盒購自Invitro?gen；逆轉錄試劑盒購自Promega；CCK-8 試劑盒和RIPA 細胞裂解液購自上海碧云天生物研究所；抗VEGF、E-cadherin、vimentin 和 β-catenin 抗體及辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自Abcam；Lipfectamine 2000轉染試劑盒購自Thermo Fisher。

2 儀器

酶標儀購自Thermo Fisher；熒光顯微鏡購自Nikon；電泳儀及半干轉膜儀均購自Bio-Rad；實時熒光定量PCR儀購自ABI。

3 實驗方法

3.1 CCK-8 實驗 按CCK-8 試劑盒說明書進行操作，于96 孔板中，每孔接種5×103個細胞，每組3 個復孔，培養24 h；將12個濃度梯度（0、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100、200、300 和400 μmol/L）的藁本內酯，分別加入對應的12 組孔中，37℃孵育24 h；每孔加入10μL的CCK-8試劑，37℃孵育1 h；酶標儀檢測每孔450 nm 波長處的吸光度，并計算細胞相對活力。實驗重復3次。

3.2 EdU 染色實驗 按照細胞增殖檢測試劑盒說明書進行操作，于24 孔板中每孔接種3×104個細胞，培養 24 h；加入 0、10、25 和 50 μmol/L 的藁本內酯處理細胞；再經過血清剝奪，培養48 h；加入20μmol/L EdU 工作液，孵育2 h；加入4%多聚甲醛，并固定15 min；加入200 μL click 反應液避光孵育30 min；使用Hoechst 33342染料進行細胞核染色；熒光顯微鏡，鏡下觀察；使用ImageJ 軟件計算EdU 陽性細胞；實驗重復3次。

3.3 微管形成實驗 提前用不同濃度（0、10、25、50μmol/L）的藁本內酯處理HemECs細胞；將Matrigel與4℃預冷的無血清EGM-2MV 培養基按1：1 比例混合后平鋪于24 孔板的孔底，每孔300μL，孵育30 min；取先前處理的細胞1.2×108/L 后接種于上述在鋪好膠的 24 孔板中，每孔 1 mL，孵育 16 h，每隔 4 h 觀察微管樣結構形成情況，光學顯微鏡下隨機取5 個視野拍照；采用Microvision Saisam 軟件分析圖像，并對微管樣結構進行計數，實驗重復3次。

3.4 Western blot 檢測VEGF 及上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關標志物的表達 用0、10、25和50μmol/L濃度的藁本內酯處理 HemECs 于 6 孔板中培養 48 h；使用 RIPA 裂解液將先前處理的細胞進行裂解，提取總蛋白；使用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度；10% SDS-PAGE 分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜；用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白1 h，隨后加入Ⅰ抗（VEGF、E-cad?herin、vimentin和β-catenin抗體稀釋度均為1∶1 000），4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗（稀釋度為1∶1 000），室溫孵育2 h；按照同樣的方法與β-actin抗體孵育；ECL化學發光試劑顯色。

3.5 鏡下觀察細胞形態的變化 用不同濃度（0、10、25 和 50 μmol/L）的藁本內酯處理 HemECs 于6 孔板中培養48 h；光學顯微鏡下隨機取5 個視野拍照；取對數生長期的細胞于倒置顯微鏡下培養，觀察各組細胞形態。

3.6 轉染實驗 按照轉染試劑盒說明書進行，轉染前，細胞以每孔5×105個接種于6孔板中，待細胞達到80%～90%融合時準備轉染，設立未轉染組（無特殊處理）、空載體組（轉染pcDNA3.1 載體）和VEGF 轉染組（轉染pcDNA3.1-VEGF165 質粒）。采用Lip?fectamine 2000 轉染，4 h 后更換正常培養液進行培養，48 h后進行相關檢測。

3.7 RT-qPCR實驗檢測VEGF的mRNA表達 按照TRIzol 試劑盒說明書提取總RNA；根據逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，于PCR儀中進行擴增。反應條件為：95℃ 10 s、60℃ 20 s、70℃ 10 s，40 個循環。以β-actin 為內參照。VEGF 上游引物序列為5'-AT?GAACTTTCTGCTGTCTTGG-3'，下游引物序列為5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACA-3'；β-actin 上游引物序列為5'-ATCTGGCACCACACCTTCTA-3'，下游引物序列為5'-CTTCTTAATGTCACGCACGA-3'。

4 統計學處理

采用SPSS 19.0對所有實驗數據進行統計分析，采用單因素方差分析，并用SNK-q檢驗進行組間兩兩比較。實驗結果以均數±標準差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CCK-8 實驗檢測不同濃度藁本內酯對HemECs活力的影響

CCK-8 實驗結果表明，與對照組相比，100～400μmol/L 藁本內酯處理組的細胞活力顯著降低（P＜0.05），而 0.1～50 μmol/L 的藁本內酯處理對細胞活力的影響并不明顯，故選擇藁本內酯對HemECs 無顯著毒性的濃度（10、25 和50 μmol/L）進行后續的研究，見圖1。

Figure 1.The effect of ligustilide at different concentrations on the viability of HemECs.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖1 不同濃度的藁本內酯對HemECs活力的影響

2 EdU染色檢測藁本內酯對HemECs增殖的影響

EdU 染色結果表明，與對照組相比，25 和50μmol/L 藁本內酯處理組的EdU 陽性（紅色熒光）細胞顯著減少（P＜0.05），即增殖的細胞顯著減少，見圖2。

Figure 2.The effect of ligustilide on the proliferation of HemECs detected by EdU staining（×200）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖2 EdU染色檢測藁本內酯對HemECs增殖的影響

3 微管形成實驗檢測藁本內酯對HemECs 血管新生的影響

微管形成實驗結果可見，對照組中的微管樣結構完整而典型，25 和50 μmol/L 藁本內酯處理組的微管樣結構被破壞，斷斷續續、不完整，典型的微管樣結構顯著減少；通過計數，25 和50μmol/L 藁本內酯處理組相較于對照組的微管樣結構數量顯著減少（P＜0.05），見圖3。

4 Western blot 檢測藁本內酯對HemECs中VEGF蛋白表達水平的影響

與對照組相比，25和50μmol/L 藁本內酯處理組VEGF蛋白表達顯著下降（P＜0.05），見圖4。

5 顯微鏡下觀察藁本內酯對HemECs 上皮-間充質形態轉換的影響

顯微鏡下觀察細胞形態顯示，對照組細胞呈梭形，細胞間連接松散；與對照組相比，25和50μmol/L藁本內酯處理組的細胞呈橢圓形，細胞密集，細胞間隙小，見圖5。

Figure 3.The effect of ligustilide on angiogenesis of HemECs detected by microtubule formation experiment（×100）.Mean±SD. n=9.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group.圖3 微管形成實驗檢測藁本內酯對HemECs血管新生的影響

Figure 4.The effect of ligustilide on the protein expression of VEGF in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0μmol/L group.圖4 藁本內酯對HemECs VEGF蛋白表達水平的影響

Figure 5.The effect of ligustilide on the morphological changes of epithelial-mesenchymal transition in HemECs was observed under microscope（×100）.圖5 顯微鏡觀察藁本內酯對HemECs上皮-間充質形態轉換的影響

6 Western blot 檢測藁本內酯對HemECs 中EMT標志蛋白表達的影響

Western blot 實驗結果顯示，與對照組相比，25和50μmol/L 藁本內酯處理組的E-cadherin 蛋白表達水平顯著上調（P＜0.05），vimentin 蛋白和β-catenin蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見圖6。

7 蒿本內酯對VEGF 過表達引起的血管新生和EMT的影響

RT-qPCR 實驗結果顯示，與對照組（未轉染組）相比，VEGF 組的mRNA 表達量上調（P＜0.05），見圖7A，說明VEGF 過表達成功。Western blot 實驗結果顯示，與對照組相比，VEGF 組的VEGF 蛋白表達顯著上調（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表白顯著下調（P＜0.05），vimentin 蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；與VEGF組相比，ligustilide+VEGF 組的VEGF蛋白表達顯著下調（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達顯著上調（P＜0.05），vimentin 蛋白表達顯著下調（P＜0.05），見圖7B。

討 論

Figure 6.The effect of ligustilide on the expression of epithelial-mesenchymal transition marker proteins in HemECs was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs 0μmol/L group.圖6 Western blot檢測藁本內酯對HemECs中上皮-間充質轉化標志蛋白表達的影響

血管瘤是一種常見的嬰幼兒良性腫瘤，具有獨特的演變周期，包括增生期與消退期。大多數血管瘤未經治療可自行消退，但是少數血管瘤會干擾視力、呼吸，甚至導致組織或器官損傷，并在某些情況下威脅生命。雖然發病機制尚不清楚，但與血管瘤內皮細胞異常增生密切相關。藁本內酯是苯酞類化合物的典型代表，具有抑制脂質過氧化、改善微循環和抑制腫瘤細胞增殖等作用［9］，其中藁本內酯的抗腫瘤作用越來越受到關注。

研究表明，血管瘤內皮細胞異常增生，病理特征表現為局部雜亂無章的血管過度增生及異常增生的內皮細胞。在血管瘤的治療方法中，抑制血管瘤內皮增生是一個重要的途徑，血管瘤的治療藥物普萘洛爾可以通過抑制血管瘤內皮胞的增生，并促進其凋亡，達到治療的目的［10］。EdU 染色實驗結果中，25和50 μmol/L 藁本內酯處理組的EdU 陽性細胞顯著少于對照組，說明藁本內酯能夠抑制血管瘤內皮細胞的增殖。

Figure 7.The effect of ligustilide（50 μmol/L）on VEGF overexpression-induced angiogenesis and epithelial-mesenchymal transition in HemECs.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：the protein levels of VEGF，E-cadherin and vi?mentin were detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs VEGF group.圖7 蒿本內酯對VEGF過表達引起的血管新生和上皮-間充質轉化的影響

腫瘤血管生成是指腫瘤細胞誘導毛細血管新生，為腫瘤的生長提供必要的物質基礎。在微管形成實驗的結果中，與對照組相比，25 和 50 μmol/L 藁本內酯處理組微管樣結構的數量顯著減少，說明藁本內酯抑制腫瘤細胞的血管新生。腫瘤血管形成是一個復雜過程，受多種因子調節，是刺激因素和抑制因素失衡的結果。VEGF 是目前所知的誘導血管生成最重要的生長因子，也是血管瘤治療中的重要靶點［11-13］，雷帕霉素治療血管瘤就是通過降低VEGF 水平，達到治療的目的［14］。25和50 μmol/L 藁本內酯處理組與對照組相比，VEGF 蛋白表達顯著下降，說明藁松內酯可以下調血管瘤內皮細胞的VEGF 的表達，同時提示藁本內酯與VEGF 之間可能存在靶向關系。

EMT 是具有極性的上皮細胞轉換為具有活動能力的間質細胞并獲得侵襲和遷移能力的過程［15-16］。而血管瘤惡性化主要表現是血管瘤的高速生長或侵襲。在EMT 的過程中，上皮細胞特征標志物E-cad?herin［17］表達下調，間充質細胞標志物vimentin［18］和βcatenin［19］蛋白表達上調。通過 Western blot 檢測，與對照組相比，25 和50 μmol/L 藁本內酯處理組的E-cadherin 蛋白表達水平顯著上調，vimentin 和βcatenin 蛋白表達顯著下調，表明藁本內酯具有抑制HemECs EMT的作用。

EMT 是一個由多種途徑共同調控的過程，已有研究表明 VEGF 與 EMT 過程密切相關［20-21］。本研究通過構建過表達VEGF的質粒發現，VEGF能夠引起HemECs 的 E-caderin 蛋白表達下調和 vimentin 表達上調，促進EMT；而藁本內酯則能阻斷VEGF 過表達引起的EMT。

綜上所述，藁本內酯能夠抑制HemECs 的增殖，并通過降低VEGF 水平抑制HemECs 的血管新生及EMT過程。