青藤堿通過ANRIL/miR-626軸減輕MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷*

霍穎浩，王 進，殷立新

（河北醫科大學第二醫院 1神經內科，2藥學部，河北石家莊050000）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是中樞神經系統退行性疾病，主要表現為運動緩慢、震顫、感覺障礙等。PD 多發生于老年人群，隨著社會老齡化的加劇，PD 發病率呈增長趨勢［1］。目前，PD 的發病機制尚未闡明，已證實氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥等引起的細胞凋亡與PD 關系密切［2-3］。臨床主要采用左旋多巴治療PD，但長期療效不佳，因此探究PD發病機制并尋找有效的治療靶點十分重要。

青藤堿（sinomenine，SN）是中藥青風藤的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等多種藥理學功效［4-5］。研究顯示，SN可改善缺氧誘導的神經元形態，促進神經元存活，抑制神經元凋亡［6］。SN 可抑制氧糖剝奪誘導的大鼠海馬神經元凋亡及乳酸脫氫酶的釋放，減輕神經元的損傷［7］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，可在轉錄、轉錄后、表觀遺傳等多個方面調控基因的表達，參與細胞生長、分化和凋亡等生命過程，與神經系統疾病的發生發展密切相關［8］。ANRIL 是近年來新發現的一種lncRNA。研究顯示，ANRIL 在PD 患者體內差異性表達［9］。生物信息學軟件預測顯示，微小RNA-626（microRNA-626，miR-626）的靶基因可能是ANRIL。研究顯示，miR-626 在PD 患者腦脊液中表達降低，可能是PD診斷和監測的新的生物標志物［10］。

本研究以人神經母細胞瘤SK-N-SH 細胞為研究對象，主要探討SN對1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridine，MPP+）誘導 SK-N-SH 細胞氧化應激及凋亡的影響，并以ANRIL/miR-626 為切入點，探討SN 減輕MPP+所致SK-N-SH 細胞損傷的作用機制，以期為PD的治療提供新思路。

材料和方法

1 細胞和實驗試劑

人神經母細胞瘤SK-N-SH 細胞（中國科學院上海細胞庫）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RPMI-1640 培養基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；Trizol試劑和 LipofectamineTM2000 試劑盒（Invitrogen）；逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；膜聯蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗人Bcl-2 和Bax 多克隆抗體（Abcam）；雙螢光素酶活性檢測試劑盒（北京威格拉斯生物技術有限公司）；靶向ANRIL的小干擾RNA［ANRILsmall interfering RNA（siRNA），si-ANRIL］及亂序無意義陰性序列（negative control siRNA，si-NC），ANRIL過表達載體（pcDNA-ANRIL）及空載體（pcDNA），miR-626 模擬物（mimics）及陰性對照（上海吉凱基因公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 SK-N-SH 細胞用含10% FBS 的DMEM 培養基置于培養箱（37℃、5%CO2、97%濕度）中培養。每2～3 d 更換1 次新鮮的培養基。待細胞匯合至80%～90%時，吸棄培養基，加入適量預冷的PBS清洗細胞。吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進行傳代培養。

2.2 細胞轉染 將對數生長期的SK-N-SH 細胞以每孔1×105個接種于6 孔板中。待細胞匯合至60%時，分別將si-ANRIL、si-NC、pcDNA-ANRIL 及pcDNA轉染至SK-N-SH 細胞，具體轉染過程參照Lipo?fectamineTM2000試劑盒說明書。轉染后12 h，更換新鮮培養基，繼續培養至48 h后，采用RT-qPCR檢測細胞中ANRIL 水平以驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

2.3 細胞分組和處理 未轉染的SK-N-SH 細胞分為對照（control，Con）組（細胞正常培養）、MPP+組（100 μmol/L［11］的 MPP+作用細胞 24 h）、MPP++SN-L組、MPP++SN-M 組和MPP++SN-H 組（濃度分別為5、10、20 μmol/L［6］的SN 與100 μmol/L 的MPP+共同作用細胞 24 h）。轉染 si-ANRIL 和 si-NC 的 SK-N-SH 細胞均用 100 μmol/L 的 MPP+作用 24 h，分別記為 MPP++si-ANRIL 組和MPP++si-NC 組。轉染pcDNA-ANRIL和 pcDNA 的 SK-N-SH 細胞均用 20 μmol/L 的 SN 與100 μmol/L 的 MPP+共同作用 24 h，分別記為 MPP++SN+pcDNA-ANRIL組和MPP++SN+pcDNA組。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 未轉染的SK-NSH 細胞及轉染后的 SK-N-SH 細胞，以每孔 1×104個接種于24孔板中。細胞貼壁后，按照2.3分組處理，每組設置3 個復孔。培養后，收集細胞培養上清液，-20℃保存備用。胰蛋白酶消化細胞，PBS 清洗細胞2 次。取含1.0×106個細胞的細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，加入400μL結合緩沖液重懸細胞。加入10 μL annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5μL PI，室溫避光孵育5 min。再加入100μL結合緩沖液，混勻后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.5 細胞培養上清液中MDA 和GSH 水平的檢測將2.4 收集的細胞培養上清液3 500 r/min 離心10 min，分別參照MDA 和GSH 試劑盒說明書檢測上清中MDA和GSH水平。

2.6 Western blot 法檢測細胞中 Bax 和 Bcl-2 蛋白 的表達水平 RIPA 蛋白裂解液各組細胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min，上清液即為總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。取適量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg 蛋白行SDS-PAGE（5%濃縮膠，10%分離膠）。電泳后，將分離的蛋白條帶濕轉至聚偏二氟乙烯膜，并于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入抗Bax 和Bcl-2 抗體（1∶400 稀釋），4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標記的IgG（1∶200 稀釋），37℃孵育1 h。加入ECL 化學發光試劑，避光顯影后凝膠成像系統曝光拍照。以GAPDH 為內參照，ImageJ 軟件分析目的蛋白條帶灰度值。目的蛋白水平以其與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 檢 測 細 胞 中 ANRIL 和 miR-626 的 表達水平 Trizol 試劑提取細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度后，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進行擴增，反應總體系為20 μL，其中上、下游引物各0.5 μL。擴增程序為：95℃ 10 min；95℃ 5 s，60℃60 s，72℃ 30 s，35個循環。ANRIL 的上游引物序列為5'-TGAACGTGCCCGATGCTGG-3'，下游引物序列為 5'-CCGTGCCTTGAGCTAGCTC-3'；miR-626 的 上游引物序列為5'-GTGCGATCGTAAACCGTC-3'，下游引物序列為5'-CCGTGAAATGCTAGCTGA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TGAACGGGAAGCT?CACTGG-3'，下游引物序列為5'-TCCACCACCCT?GTTGCTGTA-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTC?GCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AAC?GCTTCACGAATTTGCGT-3'。ANRIL 以 GAPDH 為內參照，miR-626 以 U6 為內參照，采用 2-ΔΔCt法計算ANRIL和miR-626的相對表達水平。

2.8 雙螢光素酶報告基因實驗驗證ANRIL 和miR-626 的靶向關系 生物信息學軟件預測ANRIL 與miR-626 的結合片段。PCR 擴增含miR-626 結合位點的ANRIL 序列，并將其插入至pMIR-REPORT 中，構建ANRIL 野生型質粒（WT-ANRIL）；再利用基因突變技術將結合位點突變，構建ANRIL 突變型質粒（MUT-ANRIL）。分別將ANRIL-WT、ANRIL-MUT 與miR-626 mimic、陰性對照共轉染至SK-N-SH 細胞。轉染24 h 后，收集細胞。參照雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測螢光素酶相對活性。

3 統計學處理

利用SPSS 22.0 軟件分析實驗數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SN對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激的影響

與control 組比較，MPP+組的MDA 水平升高（P＜0.05），GSH 水平降低（P＜0.05）；與 MPP+組比較，MPP++SN-L 組 、MPP++SN-M 組 和 MPP++SN-H 組 的MDA 水平降低（P＜0.05），GSH 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SN-H 組 3組間MDA 和GSH 水平的差異有統計學顯著性（P＜0.05），見圖1。

2 SN對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

與control 組比較，MPP+組細胞的凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P＜0.05）；與 MPP+組比較，MPP++SN-L 組、MPP++SN-M組和MPP++SN-H 組的細胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），且MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SN-H 組 3 組間細胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白水平的差異有統計學顯著性（P＜0.05），見圖2。

3 SN 對 MPP+誘 導 SK-N-SH 細 胞 中 ANRIL 和miR-626表達的影響

與control 組比較，MPP+組細胞中ANRIL 水平升高（P＜0.05），miR-626 水平降低（P＜0.05）；與MPP+組比較，MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SNH 組的ANRIL 水平降低（P＜0.05），miR-626 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和MPP++SN-H 組 3 組間 ANRIL 和 miR-626 水平的差異有統計學顯著性（P＜0.05），見圖3。

4 ANRIL靶向調控miR-626的表達

Figure 1.The effect of SN on MPP+-induced oxidative stress in the SK-N-SH cells.The levels of MDA（A）and GSH（B）in the SKN-SH cell culture supernatants were detected.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖1 SN對MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激的影響

Figure 2.The effect of SN on the apoptosis of the SK-N-SH cells induced by MPP+.A：the apoptotic rate of the SK-N-SH cells was de?termined by flow cytometry；B：the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+ group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖2 SN對MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡的影響

Figure 3.The effect of SN on the expression of ANRIL（A）and miR-626（B）in the SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖3 SN對MPP+誘導SK-N-SH細胞中ANRIL和miR-626表達的影響

由圖4A 可見，生物信息學軟件預測顯示ANRIL序列中含有與miR-626 互補的核苷酸序列。雙螢光素酶活性檢測結果顯示，miR-626 可降低WT-ANRIL的螢光素酶活性（P＜0.05），而對MUT-ANRIL 的螢光素酶活性無顯著影響（P＜0.05），見圖4B。與pcDNA組比較，pcDNA-ANRIL 組的 miR-626 水平降低（P＜0.05）；與 si-NC 組比較，si-ANRIL 組的 miR-626 水平升高（P＜0.05），見圖4C。這些結果說明ANRIL 靶向負調控miR-626的表達。

Figure 4.ANRIL targeted miR-626 and regulated its expression.A：ANRIL contains the nucleotide sequences complementary to miR-626；B：the dual-luciferase reporter experiment results；C：ANRIL regulated miR-626 expression.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNAgroup；&P＜0.05 vs si-NC group.圖4 ANRIL靶向調控miR-626表達

5 敲減ANRIL 的表達對MPP+誘導SK-N-SH 細胞損傷的影響

MPP++si-ANRIL 組的 ANRIL 水平低于 MPP++si-NC組，miR-626水平高于MPP++si-NC組，見圖5A、B。這表明si-ANRIL 在MPP+誘導的SK-N-SH 細胞中轉染成功，細胞中ANRIL 表達受到抑制，而受ANRIL抑制的miR-626 表達水平升高。與MPP++si-NC 組比較，MPP++si-ANRIL 組的細胞凋亡率、Bax 蛋白水平和 MDA 水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白和GSH 水平升高（P＜0.05），見圖5C～F。

Figure 5.The effect of ANRIL expression knock-down on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect of ANRIL small interfering RNA（si-ANRIL）after transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfection of si-ANRIL；C：the effect of ANRIL expression knock-down on the apoptotic rate of SK-N-SH cells induced by MPP+；D：the effect of ANRIL expression knock-down on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells induced by MPP+；E：the effect of ANRIL expression knock-down on MDA content in the culture supernatants of SK-N-SH cells in?duced by MPP+；F：the effect of ANRIL expression knock-down on GSH content in the culture supernatants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP++si-NC group.圖5 敲減ANRIL表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響

6 ANRIL 過表達逆轉了SN 對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

MPP++SN+pcDNA-ANRIL 組 的 ANRIL 水 平 高 于MPP++SN+pcDNA 組，表明ANRIL過表達載體轉染成功，細胞中ANRIL 過表達，見圖6A。與MPP++SN+pcDNA 組比較，MPP++SN+pcDNA-ANRIL 組的細胞凋亡率、Bax蛋白表達和MDA 水平均升高（P＜0.05），miR-626 表達、Bcl-2 蛋白和 GSH 水平均降低（P＜0.05），見圖6B～F。

討 論

Figure 6.Over-expression of ANRIL reversed the effects of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect ofANRIL over-expression vector transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfected with ANRIL over-expression vector；C：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell apoptosis；D：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells in?duced by MPP+；E：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MDA content in the culture supernatants of SK-NSH cells induced by MPP+；F：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on GSH content in the culture superna?tants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP+group；#P＜0.05 vs MPP++SN+pcDNA group.圖6 ANRIL過表達逆轉了SN對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

PD 是多發生于老年人的神經系統退行性疾病，嚴重影響患者生活質量，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。氧化應激等引起的神經細胞凋亡與PD的發病機制密切相關［12-13］。MDA 是脂質過氧化產物之一，其水平高低可反映細胞氧化損傷程度［14］。GSH 是抗氧化劑，可增強機體抗氧化能力［15］。本研究顯示MPP+誘導SK-N-SH 細胞后，細胞培養上清液中MDA 水平升高，GSH 水平降低，細胞凋亡率增加，與相關研究報道結果一致［16］，說明SK-N-SH 細胞在MPP+誘導后發生氧化應激和凋亡，細胞受損。與PD的病理過程有相似之處。

SN 是從中藥青風藤中分離提純獲得的活性堿，在臨床上主要用于治療系膜增生性腎小球腎炎、類風濕性關節炎等疾?。?7］。研究還顯示SN 對腦出血、腦缺血、神經退行性疾病等多種中樞神經系統疾病模型具有神經保護作用［18］。但SN 在PD 中的作用及機制還未知。本研究顯示，SN 可降低MPP+誘導的SK-N-SH 細胞上清液的MDA 水平，提高GSH 水平，說明SN 通過抑制MPP+誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激減輕細胞損傷。細胞凋亡是細胞基本的生理過程，有助于維持細胞內穩態。Bcl-2 和Bax 在細胞凋亡過程中發揮重要作用，Bcl-2表達升高可抑制細胞凋亡，而Bax 表達升高則促進細胞凋亡。本研究顯示，SN 可降低MPP+誘導的SK-N-SH 細胞凋亡率和Bax 蛋白表達，促進Bcl-2 蛋白表達，提示SN 通過調控Bcl-2 和Bax 蛋白表達抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

lncRNA 在神經系統疾病中發揮重要作用，可作為該類疾病的治療靶點［19］。研究顯示，抑制ANRIL基因表達可通過阻斷核因子κB 信號傳導途徑減輕糖尿病大鼠視網膜病變［20］。本研究顯示，MPP+誘導后，SK-N-SH 細胞中的ANRIL 表達水平升高，而SN可降低MPP+誘導的SK-N-SH 細胞中ANRIL 水平，提示ANRIL 可能參與神經細胞氧化應激的發生發展，是潛在的PD 治療的作用靶點。通過轉染si-ANRIL至SK-N-SH細胞敲減ANRIL表達后，MPP+誘導的SKN-SH細胞凋亡及細胞培養上清液中MDA水平降低，GSH 水平升高，說明敲減ANRIL表達可降低MPP+誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激和凋亡。本研究還顯示，ANRIL 過表達逆轉了SN 對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡及MDA 和GSH 表達的影響，提示SN 通過下調細胞中ANRIL 表達減輕MPP+誘導SK-N-SH 細胞損傷。

為了進一步探討SN 通過下調ANRIL 表達減輕MPP+誘導的SK-N-SH細胞氧化應激和凋亡的作用機制，本研究應用生物信息學軟件進行測試，結果顯示miR-626 的靶基因可能是ANRIL。研究表明miR-626過表達可保護視網膜色素上皮細胞免受過氧化氫誘導的氧化損傷，抑制細胞凋亡［21］。目前，miR-626 對MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷的影響還不清楚。本研究通過雙螢光素酶報告基因實驗及RT-qPCR檢測證實了ANRIL 在SK-N-SH 細胞中靶向負調控miR-626 表達，這也與 SN 降低 MPP+誘導的 SK-N-SH 細胞ANRIL 表達并促進miR-626 表達的結果一致，提示SN 可能通過下調細胞中ANRIL 表達進而上調miR-626 表達，從而抑制MPP+誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激和凋亡。

綜上所述，本研究從細胞層面進行的初步探討結果提示SN 可抑制MPP+誘導的SK-N-SH 細胞氧化應激和凋亡，其機制可能是通過調控ANRIL/miR-626 通路發揮作用。了解上述病理變化可為探討PD的發病機制提供參考。