斯鈣素2在糖尿病視網膜病變中的表達和意義*

常永杰，周利曉

（鄭州大學第五附屬醫院眼科，河南鄭州450052）

近年來，糖尿病的發病率持續升高，并呈現年輕化的態勢。而糖尿病作為一種代謝性疾病，可引發諸多嚴重的并發癥，例如糖尿病足、糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）、中風、脂肪肝及腎臟疾病［1-2］。其中DR 嚴重影響糖尿病患者的生活品質，臨床上的表現為黃斑水腫、視網膜新生血管和玻璃體出血等，患者如不及早干預治療，嚴重的可導致失明［3-4］。臨床上，針對DR 的治療主要有激光治療、抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth fac?tor，VEGF）治療和皮質類固醇治療［5-6］。已有研究表明，視網膜血管內皮細胞的異常增生是DR 的一個重要特征，DR 的病理發展過程是多因素共同的結果，其發病機制還不是特別清楚，有待進一步深入的研究［7］。斯鈣素2（stanniocalcin 2，STC2）是一種體內廣泛表達的可分泌蛋白，近年來越來越多的研究發現其異常表達與多種疾病存在密切的聯系，主要集中在惡性腫瘤中，如肺癌、肝癌、乳腺癌等［8-9］。目前的一些研究表明，STC2在糖尿病的發展過程中發揮潛在的功能，但關于其在DR 中的表達尚無相關的報道。本研究從糖尿病大鼠模型入手，檢測STC2 在DR大鼠玻璃體中的表達，分析其與VEGF的聯系，并在大鼠視網膜神經節細胞中探討STC2和VEGF表達上的調控關系，對于深入分析STC2 在DR 中的作用具有一定的啟發意義。

材料和方法

1 主要試劑

B27 無血清培養基和培養細胞用雙抗購自Gib?co；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR實時熒光定量PCR 試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和蛋白marker 購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 細胞裂解液和預制SDS-PAGE 膠購買于碧云天生物科技有限公司；STC2 ELISA 試劑盒購自上海江萊生物科技公司；VEGFA ELISA 試劑盒購自Abcam；VEGFA和STC2重組蛋白均購自北京義翹神州公司；抗STC2抗體和Protein A/G 瓊脂糖珠購自Santa Cruz；抗VEGF 抗體、羊抗鼠II 抗、羊抗兔II 抗和用于免疫共沉淀的IgG均購自Proteintech。

2 實驗動物

Wistar大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證編號為SCXK（滬）2017-0005，隨機分為正常對照（control）組和DR 組，每組12 只，糖尿病模型通過腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）進行構建，STZ使用0.1 mmol/L的檸檬酸鈉溶液配制。腹腔注射2 d 后，尾靜脈取血測定血糖濃度，血糖濃度高于20 mmol/L 認為糖尿病模型構建成功。糖尿病模型組每周腹腔注射STZ 2 次，維持4 周，然后繼續觀察至第8 周，每兩周測定一次血糖。DR 模型構建成功的標志是大鼠眼睛晶體混濁，并伴有活動遲緩、毛發變黃等情況［10］。大鼠血糖水平采用葡萄糖氧化酶法，使用的設備是羅氏的血糖儀及對應試紙。

3 主要方法

3.1 大鼠視網膜神經節細胞培養 大鼠視網膜神經節細胞購于普諾賽生物技術公司，培養于大鼠視網膜神經節細胞完全培養基，添加B-27 和細胞培養級雙抗，置于37℃、5%CO2培養箱中。細胞傳代使用胰蛋白酶和膠原酶聯合消化法，傳代不超過5次。

3.2 RT-qPCR 大鼠玻璃體組織經勻漿后，加入RNA 提取試劑，室溫反應10 min，加入相同體積氯仿，劇烈振蕩30 s 后靜置5 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清轉移到新的離心管中，加入相同體積預冷的異丙醇溶液，混勻后靜置5 min，12 000 r/min 離心10 min，小心棄去上清，75%乙醇洗滌白色沉淀2次，得到的白色沉淀即為總RNA。風干后加入經DEPC 預處理的去離子水，使用翊圣的反轉錄試劑盒預處理RNA，去除可能殘余的基因組DNA，加入逆轉錄酶反轉錄合成第1 鏈cDNA。使用翊圣的SYBR熒光定量PCR 試劑盒配制反應體系，熔解曲線確定引物特異性，2-ΔΔCt法分析 STC2 和 VEGF mRNA 的相對表達水平。STC2 的正向引物序列為5'-CTGGGC?CAGTTTGTGACCC-3'，反向引物序列為5'-ACG TCATGCAAATCCCATGTAAA-3'；VEGF 的正向引物序列為5'-GCTACTGCCGTCCGATTGAG-3'，反向引物序列為5'-ACTCCAGGGCTTCATCGTTACAG-3'；內參照β-actin 的正向引物序列為5'-GTGACGTTGA?CATCCGTAAAGA-3'，反向引物序列為5'-GCCG?GACTCATCGTACTCC-3'。

3.3 Western blot 實驗 在大鼠玻璃體組織中加入RIPA 裂解液，經超聲破碎后，12 000 r/min 離心，去除沉淀，濃縮蛋白裂解液，經SDS-PAGE 分離，轉印到PVDF 膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗滌2 次后，4℃過夜孵育I 抗，TBST 洗滌3 次，室溫孵育 II 抗 1 h，TBST 洗滌 3 次后，經 ECL 顯影。采用Quantity One軟件進行蛋白表達量的半定量分析。

3.4 ELISA實驗 大鼠玻璃體組織經PBS反復潤洗后，收集潤洗液，冷凍濃縮，濃縮液加入預包被好的STC2和VEGFA試劑盒中，37℃反應1 h；加入生物素標記的抗體工作液，反應30 min；棄去液體，甩干，加入生物素標記的抗體，37℃反應1 h；棄去液體，甩干，洗板3 次，加入鏈親和素-辣根過氧化物酶工作液，37℃反應30 min；棄去液體，洗板3 次，加入四甲基聯苯胺溶液，37℃反應15 min；當標準品孔呈現明顯梯度，加終止液，450 nm波長下測定吸光度。

3.5 VEGFA或STC2蛋白處理大鼠視網膜神經節細胞 將大鼠視網膜神經節細胞接種于6 孔板中，培養 24 h 后，用 100 μg/L 的 VEGFA 或 STC2 蛋白處理細胞。孵育24 h 后，回收培養上清液，用ELISA 測定其中STC2 和VEGFA 的水平；細胞刮取后，經預冷的PBS 洗滌 2 次，用 RT-qPCR 和 Western blot 檢測細胞中STC2和VEGF的表達水平。

3.6 免疫共沉淀驗證VEGF 與STC2 的相互作用將大鼠視網膜神經節細胞接種于15 cm 培養皿中，VEGFA 蛋白預處理 6 h；刮取細胞，PBS 洗 2 次，加入1 mL 低強度RIPA 裂解液冰上裂解1 h；離心取上清液，加入Protein A/G 瓊脂糖珠，于4℃冰箱中旋轉孵育1 h；然后等分到兩個離心管中，分別加入IgG 和抗VEGF 抗體（1∶100 稀釋），于4℃冰箱中繼續孵育12 h；然后 500×g離心，收集瓊脂糖珠，低強度 RIPA 裂解液輕輕洗滌2次，收集瓊脂糖珠；加入RIPA裂解液和蛋白上樣溶液，99℃加熱10 min；離心取上清，去除瓊脂糖珠，后續步驟同常規Western blot。

4 統計學處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件處理數據。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用Student'st檢驗。兩變量的相關性采用Pearson分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DR大鼠玻璃體中STC2的表達升高

分別在第2、4、6 和8 周檢測對照組和模型組動物血糖，模型組動物血糖均超過20 mmol/L，見表1。這表明STZ 注射的糖尿病大鼠模型構建成功。糖尿病模型維持8 周后，大鼠眼球出現晶體狀混濁現象，則認為DR 模型構建成功。RT-PCR 和Western blot結果顯示，DR 組中STC2 的mRNA 和蛋白水平較正常對照組顯著升高（P＜0.01），見圖 1A～C。鑒于STC2 屬于分泌型蛋白，進一步通過ELISA 測定大鼠玻璃體潤洗液中STC2的蛋白含量，結果顯示，DR組分泌的STC2 蛋白水平也顯著高于正常對照組（P＜0.01），見圖1D。

表1 不同時點糖尿病模型和對照組大鼠血糖水平的比較Table 1.The blood glucose concentration in diabetic model and control rats at different time points（mmol/L.Mean±SD. n=12）

Figure 1.The expression level of STC2 was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of STC2 was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of STC2；C：the relative protein level was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖1 DR大鼠玻璃體中STC2的表達升高

2 VEGF在DR大鼠玻璃體中表達升高

相對于正常對照組，DR 組中 VEGF 的 mRNA 和蛋白水平明顯升高（P＜0.01），見圖2A～C。進一步通過ELISA 檢測VEGF 信號通路關鍵的VEGFA 的分泌水平，結果顯示，DR組大鼠玻璃體VEGFA 蛋白分泌水平顯著高于正常對照組（P＜0.01），見圖2D。

Figure 2.The expression level of VEGF was increased in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy（DR）.A：the mRNA level of VEGF was detected by RT-qPCR；B：Western blot was used to test the protein expression of VEGF；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGFA was tested by ELISA.Mean±SD. n=12.**P＜0.01 vs control group.圖2 DR大鼠玻璃體中VEGF的表達升高

3 STC2與VEGF的表達水平呈正相關關系

通過分析STC2 與VEGF 表達的相關性發現，在mRNA 水平上，STC2 與 VEGF 的表達水平呈正相關關系（r=0.96，P＜0.01），而在蛋白水平，分泌的STC2蛋白與VEGFA 蛋白也存在較強的正相關關系（r=0.78，P＜0.01），見圖3。

Figure 3.The correlation analysis between STC2 and VEGF expression levels in vitreous tissues of the rats with diabetic retinopathy.A：the correlation between VEGF and STC2 mRNA levels；B：the correlation between VEGFA and STC2 secretion levels.圖3 DR大鼠玻璃體中STC2與VEGF表達水平的相關性分析

4 VEGFA 在大鼠視網膜神經節細胞中誘導STC2表達，并促進其分泌

為了進一步探討STC2 和VEGF 的關系，我們用VEGFA 處理大鼠視網膜神經節細胞，24 h 后檢測STC2 的表達水平，結果顯示，VEGFA 處理能夠促進大鼠視網膜神經節細胞中STC2 的mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.01），見圖4A～C。同時通過ELISA 考察VEGFA 處理對于STC2 分泌水平的影響，結果顯示，VEGFA 也能夠誘導大鼠視網膜神經節細胞分泌大量STC2蛋白（P＜0.01），見圖4D。

Figure 4.VEGFA induced STC2 expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of STC2 was examined by RT-qPCR；B：the protein level of STC2 was tested by Western blot；C：the relative protein level of STC2 was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of STC2 was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.圖4 VEGFA誘導大鼠視網膜神經節細胞中STC2的表達并促進其分泌

5 STC2 蛋白促進大鼠視網膜神經節細胞中VEGF的表達

為了觀察STC2 對于VEGF 信號通路的關系，我們進一步分析STC2 對VEGF 的反饋調節。用STC2蛋白孵育大鼠視網膜神經節細胞，24 h 后檢測VEGF的mRNA 和蛋白表達水平，結果顯示，STC2蛋白能夠誘導VEGF 的表達水平上調（P＜0.01），見圖5A～C。ELISA實驗結果顯示，STC2蛋白也能夠促進VEGFA的分泌，見圖5D。

6 STC2與VEGF存在相互作用

免疫共沉淀實驗結果顯示，采用VEGF 抗體可以免疫沉淀出STC2蛋白，說明STC2與VEGF 之間存在緊密的相互作用，見圖6。

討 論

本研究從構建DR 大鼠模型入手，分析DR 大鼠玻璃體中STC2 的表達，發現STC2 在DR 大鼠玻璃體中的mRNA 和蛋白水平都顯著上升。進一步發現在大鼠視網膜神經節細胞中，VEGFA 不僅能夠上調STC2的mRNA和蛋白表達水平，也能夠促進STC2的分泌。STC2是一種糖蛋白，最初的研究表明STC2在調控鈣磷平衡方面發揮重要的功能［11］。STC2 在體內廣泛表達，近年來其在惡性腫瘤中的研究越來越廣泛，其異常表達與多種惡性腫瘤的預后存在緊密的聯系［12］。同時，也有越來越多的證據顯示，STC2在代謝性疾病中也發揮重要的功能。在高脂飲食和瘦素基因敲除2 種脂肪肝模型中，肝臟中的STC2 表達顯著下降［13］；陶文玉等［14］的研究也發現在 STZ 誘導的糖尿病模型大鼠肝臟中STC2 的表達也顯著上升，并且 STC2 可以激活 STAT3 和 NF-κB 信號通路，介導肝臟炎癥應激的過程。這些研究表明STC2 可能參與糖脂代謝，介導炎癥反應，而DR 作為一種危害極大的糖尿病并發癥，STC2 在DR 中的表達及其調控功能尚無相關的報道。

Figure 5.STC2 induced VEGF expression and promoted its secretion in rat retinal ganglion cells.A：the mRNA level of VEGF was examined by RT-qPCR；B：the protein level of VEGF was tested by Western blot；C：the relative protein level of VEGF was quantified by Quantity One software；D：the secretion level of VEGF was examined by ELISA.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs PBS group.圖5 STC2誘導大鼠視網膜神經節細胞中VEGF的表達并促進其分泌

Figure 6.The interaction between VEGF and STC2 in rat retinal ganglion cells.A：the total protein was pretreated with Protein A/G agarose beads for 1 h，divided into 2 tubes and incubated with IgG and anti-VEGF antibody，respectively；B：the semiquantitation for the band of STC2 was achieved by Quantity One software.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs IgG group.圖6 在大鼠視網膜神經節細胞中VEGF與STC2存在相互作用

VEGF 信號通路在DR 過程中發揮著重要的作用［15-16］，越來越多的研究都發現VEGF 在糖尿病視網膜異常增生過程中發揮重要的作用，因此我們檢測了DR 大鼠中VEGF 的表達變化，結果顯示，DR 大鼠玻璃體中VEGF 的表達水平也顯著升高。這一結果與以往的研究是一致的。我們進一步分析了玻璃體中VEGF 的分泌情況，發現DR 大鼠玻璃體潤洗液中VEGF 的水平也顯著增加。考慮到STC2 在DR 大鼠玻璃體的異常表達，本研究分析了STC2 與VEGF 在DR 大鼠玻璃體中的關系。Pearson 積矩相關分析顯示，STC2 的 mRNA 水平與 VEGF 的 mRNA 水平呈非常明顯的正相關關系，STC2 和VEGF 分泌蛋白的表達亦呈顯著正相關相關，提示STC2 和VEGF 可能在DR過程中存在相互作用關系。

為了進一步探究在DR 過程中STC2 與VEGF 的相互作用關系，本研究利用大鼠視網膜神經節細胞分析 STC2 對 VEGF 以及 VEGF 對 STC2 的調節作用。首先，本研究發現VEGFA 能夠在mRNA 和蛋白水平誘導STC2的表達，并且ELISA 的結果也說明VEGFA能夠促進大鼠視網膜神經節細胞分泌STC2。而VEGF 在DR 過程中發揮著重要的作用，介導視網膜異常增生的過程，VEGF 可以促進STC2 的表達以及分泌水平，提示STC2極有可能是VEGF 信號通路的重要靶基因。分子間相互作用是體內分子功能調節的重要方面，因此本研究進一步分析STC2 對于VEGF 是否存在正反饋的調節。用STC2蛋白處理大鼠視網膜神經節細胞，發現STC2 能夠誘導VEGF 的表達，說明在大鼠視網膜神經節細胞中STC2 和VEGF 存在正反饋的調節。免疫共沉淀結果則顯示VEGF與STC2存在蛋白相互作用。

綜上所述，本研究發現了STC2 在DR 大鼠玻璃體中的異常表達，并且STC2 的表達與視網膜病變相關分子VEGF 存在正相關的作用關系，并且體外細胞實驗進一步闡明了STC2 與VEGF 存在正反饋調節。這表明STC2 可能在DR 過程中發揮重要的功能，可能成為DR 重要的分子靶點，這也為開發干預DR藥物提供了理論支持。