津力達聯合通心絡減輕高糖環境下腎臟微血管內皮細胞內質網凋亡*

劉紅利，孟令華，田金悅△，梁俊清，陳 檬，李輝欣

（1石家莊市第二醫院中醫科，2河北省絡病重點實驗室，河北石家莊050035）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為糖尿病慢性病程中常見的微血管并發癥之一，臨床以蛋白尿為主要表現，是引起終末期腎病（end-stage re?nal disease，ESRD）和糖尿病患者死亡的主要原因。文獻報道，我國DN 的患病率約為10%～40%］，且有上升趨勢。腎小球內皮細胞，即腎臟微血管內皮細胞（renal microvascular endothelial cells，RMECs）為腎小球濾過膜的第1 道屏障，與血液內外的循環物質接觸，并具有分泌功能，在維持局部微環境平衡中起重要作用［2-3］。持續高糖環境下RMECs 發生氧化應激、凋亡等損傷，與DN 蛋白尿的發生、發展關系密切。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導的細胞凋亡是糖尿病和其并發癥的病理形成過程中的重要參與者［4］。津力達顆粒和通心絡膠囊是在脈絡學說指導下研發的通絡代表方藥，廣泛應用于臨床心、腦、腎、糖尿病及其并發癥的治療中，既往研究結果顯示兩者協同作用可增強降糖、降脂和血管保護作用［5-6］。本課題進一步深入研究津力達聯合通心絡對高糖環境下對RMECs 內質網凋亡途徑的影響，并探討其作用機制。

材料和方法

1 動物

7 日齡SPF 級SD 胎雄性大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001。

2 藥物與試劑

津力達超微粉（藥物組成：人參、黃精、蒼術、苦參、麥冬等，石家莊以嶺藥業制備，批號S-130901）；通心絡超微粉（藥物組成：人參、赤芍、水蛭、蟬蛻、降香等，石家莊以嶺藥業制備，批號S-130901）；DMEM培養基和胎牛血清（17985）購自Sciencell；胰蛋白酶購自 Amersco；Hoechst 33342 購自 Sigma；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號KGA108）；CCK-8 檢測試劑盒（日本同仁化工所）；小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體（Abcam，批號ab119339）；活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）測試盒（南京建成生物工程研究所）；抗蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、磷酸化PERK（phosphorylated PERK，p-PERK）、葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12及Bcl-2抗體均購自Cell Signaling Technology。

3 主要儀器

多功能酶標儀（BioTek）；FACSAria Ⅲ型超速流式細胞分選系統（BD）；Odyssey 掃膜儀（LI-COR）；凝膠掃描系統（UVP）；電轉膜儀、半干轉膜儀和垂直電泳儀（Bio-Rad）；Operetta 高通量高內涵細胞分析系統（PerkinElmer）。

4 主要方法

4.1 藥液制備 津力達超微粉懸液的制備：取適量津力達超微粉溶于無血清DMEM 培養基中，超聲促溶 1 h，6 500×g離心 10 min，收集上清液并用0.22μm 微孔濾器過濾除菌，離心所得沉淀于60℃加熱烘干并稱量，以校正和計算所得上清中藥物濃度，于-20℃保存備用，用時稀釋至目標濃度。通心絡超微粉懸液制備同上。本課題中津力達和通心絡實驗濃度在前期基礎上分別確定為200 mg/L和100 mg/L。

4.2 原代RMECs 的分離、培養與鑒定 采用三步梯度篩網法［7］收集200 目網上腎血管球，0.125%胰蛋白酶消化分離腎小球后接種于含有20%胎牛血清、1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素、20 mg/L 內皮細胞生長因子和100 mg/L 肝素鈉的DMEM 培養基中，放入37℃、5%CO2細胞培養箱內，每2～3 d 換液1次。應用反復貼壁法逐步將微血管內皮細胞分離。倒置顯微鏡下觀察細胞形態，采用細胞免疫熒光法檢測RMECs 胞膜上內皮細胞特異性抗原CD31 表達，對培養的細胞進行鑒定。

4.3 高糖誘導RMECs 損傷模型的建立 取對數生長期的RMECs，0.25%胰酶消化，按1.0×108/L 密度接種于6 孔板中，待細胞生長至80%融合時，棄去舊培養基，更換含50 mmol/L 高糖的DMEM 培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中繼續培養24 h。

4.4 實驗分組 取對數生長期RMECs，10%胰酶消化，按1.0×108/L密度接種于6孔板中，待細胞生長至80%融合時，棄去舊培養基，加入含50 mmol/L 葡萄糖的高糖DMEM 培養基同步12 h，然后按分組繼續培養24 h。分組如下：正常對照（control）組，正常DMEM 培養基；高糖（high glucose，HG）組，正常培養基+50 mmol/L 葡萄糖；通心絡（Tongxinluo，TXL）組，正常培養基+50 mmol/L 葡萄糖+100 mg/L 通心絡混懸液；津力達（Jinlida，JLD）組，正常培養基+50 mmol/L 葡萄糖+200 mg/L 津力達混懸液；通心絡+津力達（TXL+JLD）組，正常培養基+50 mmol/L 葡萄糖+100 mg/L通心絡混懸液+200 mg/L津力達混懸液。

4.5 CCK-8 法測定各組RMECs 的活力 取對數生長的RMECs 接種于96 孔板，按上述分組進行干預24 h 后，棄去舊培養基，加入10 μL CCK-8 溶液，37℃避光孵育1 h 后，酶標儀 450 nm 測定吸光度（A）值，計算各組細胞活力。細胞活力（%）=實驗組A值/正常組A值×100%。實驗重復3次。

4.6 高通量高內涵觀察細胞形態學變化 取對數生長的RMECs接種于96孔板，按上述分組進行干預24 h 后，向每孔直接加入Hoechst 33342 染液，避光37℃孵育15 min，采用高通量高內涵分析系統觀察細胞核形態并拍照。

4.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數生長的RMECs 接種于6 孔板，按上述分組進行干預24 h 后，棄去舊培養基，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，加入預冷的PBS洗滌細胞2次，在細胞中添加結合緩沖液后，加入annexin V-FITC和PI各5 μL，流式細胞術檢測細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=（晚期凋亡數+早期凋亡數）/細胞總數×100%。

4.8 流式細胞術檢測ROS 水平 取對數生長的RMECs 接種于6 孔板，按上述分組進行干預24 h 后，棄去舊培養基，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用wash buffer重懸，加入含有綠色活性氧熒光探針（λEx/λEm：490/525 nm）和橙色超氧熒光探針（λEx/λEm：550/620 nm），避光37℃孵育30 min，流式細胞術檢測。實驗重復3次。

4.9 Western blot 檢 測 PERK、p-PERK、GRP78、CHOP、caspase-12 和Bcl-2 的蛋白水平 取對數生長期的RMECs接種于6孔板，按上述分組干預24 h后，棄去舊培養基，0.25%胰蛋白酶消化，加入裂解液，提取細胞總蛋白。BCA 測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸。吸取40 μg 蛋白用10% SDS-PAGE 分離后轉移到 0.45 μm PVDF 膜，5% TBS-T 牛奶封閉1 h，孵育相應抗體（1∶500），4℃搖床過夜，TBST洗膜3 次后加相應Ⅱ抗（1∶2 000）常溫震蕩1 h，TBST 洗膜3 次后加ECL 超敏發光液，凝膠化學發光成像分析系統成像分析各蛋白的水平。

5 統計學處理

用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。所有實驗均重復3 次，計量資料數據采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間數據比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），先檢驗方差齊性，若方差齊則各組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，若方差不齊則使用Dunnett T3檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 RMECs鑒定

熒光顯微鏡下可見原代培養的RMECs 形狀呈多角形或短梭形，大小較均勻，邊緣清晰，形態飽滿，胞核完整，胞漿豐富，培養8 h后細胞可融合成單層。經CD31免疫熒光鑒定顯示純度＞95%，見圖1。

Figure 1.Identification of RMECs by CD31 immunofluores?cence staining.圖1 CD31免疫熒光染色鑒定RMECs

2 各組處理對高糖損傷RMECs活力的影響

CCK-8 法檢測結果可見，與正常對照組比較，高糖誘導的RMECs 活力下降（P＜0.05）；與高糖組比較，TXL、JLD 及 TXL+JLD 組 RMECs 的活力均有增強（P＜0.05）；與JLD 組比較，TXL+JLD 組的細胞活力進一步增強（P＜0.05），見圖2。

3 RMECs的形態學改變

RMECs 經過不同組處理，高通量高內涵分析系統檢測細胞核形態，結果顯示，正常對照組的細胞核飽滿，呈橢圓形，大小均一，染色均勻；與正常對照組比較，高糖組的細胞核大小不一，染色致密，細胞核皺縮，并可見核破碎；與高糖組比較，TXL 組、JLD 組及TXL+JLD 組的細胞核較完整，染色相對均勻，見圖3。

4 各組處理對高糖損傷RMECs凋亡率的影響

Figure 2.The viability of the RMECs in each group.Mean±SD.n=6.ΔP＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs HG group.圖2 各組RMECs的活力比較

Figure 3.The nuclear morphological changes of the RMECs in each group（Hoechst 33342 staining，×400）.圖3 各組RMECs的細胞核形態學變化

RMECs經過不同組處理，流式細胞術結果顯示，與正常對照組比較，高糖誘導的RMECs 凋亡率增加（P＜0.05）；與高糖組比較，TXL 組、JLD 組及 TXL+JLD 組RMECs 的凋亡率均降低（P＜0.05）；與TXL 組和JLD 組比較，TXL+JLD 組的細胞凋亡率進一步下降，差異有統計學顯著性（P＜0.05），見圖4。

5 各組處理對高糖損傷RMECs生成ROS的影響

RMECs 經過不同組處理，采用流式細胞術檢測ROS 水平，結果顯示，與正常組比較，高糖組RMECs的 ROS 生成水平升高（P＜0.05）；與高糖組比較，TXL 組、JLD 組及 TXL+JLD 組 RMECs 的 ROS 生成水平均降低（P＜0.05）；與TXL 組和JLD 組比較，TXL+JLD 組 RMECs 的 ROS 水平進一步降低（P＜0.05），見圖5。

6 各組處理對高糖損傷的RMECs 中PERK、GRP78、CHOP、caspase-12和Bcl-2蛋白水平的影響

Figure 4.The apoptosis of the RMECs in each group analyzed by flow cytometry.Mean±SD. n=3.△P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs HG group；#P＜0.05 vs TXL or JLD group.圖4 流式細胞術檢測各組RMECs凋亡率的變化

Figure 5.The level of ROS in the RMECs of each group detected by flow cytometry.Mean±SD. n=3.△P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs HG group；#P＜0.05 vs TXL and JLD group.圖5 各組RMECs內ROS水平的比較

Western blot結果顯示，與正常組比較，高糖誘導的 RMECs 中 PERK、p-PERK、GRP78、CHOP 和 cas?pase-12 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白水平顯著下降（P＜0.05）。與高糖組比較，JLD 組、TXL 組 及 TXL+JLD 組 RMECs 中 PERK、p-PERK、GRP78、CHOP 和 caspase-12 蛋白水平均有不同程度降低（P＜0.05），而 Bcl-2 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與 TXL 組比較，TXL+JLD 組 PERK 和 caspase-12 蛋白水平進一步降低（P＜0.05）；與 JLD 組比較，TXL+JLD 組 PERK、p-PERK 和 caspase-12 蛋白水平進一步降低（P＜0.05），見圖6。

討 論

糖尿病在中醫被稱為“消渴”，DN 則歸屬“水腫”、“尿濁”、“腎消”等范疇，并且中醫學者已認識到DN 由消渴日久不愈發展而來，謂以“下消”之稱。脈絡學說是由吳以嶺院士創建的絡病理論關于脈絡病變的新理論，在治療糖尿病方面，認為“脾”是糖尿病病變的始動與核心，脾之健運失常以致水谷精微、水液代謝輸布和利用紊亂，日久“久病入絡”，“窮極必腎”，腎虛絡瘀，營衛交會生化異常，精微物質不固外溢而致DN，提出“從脾論治2型糖尿病”的理論，結合“脈絡-血管系統相關性”，確立“運脾津、通脈絡”的治療原則，研制出“運脾津”代表方藥津力達顆粒和“通脈絡”代表方藥通心絡膠囊。

津力達顆粒由益氣健脾的人參、茯苓，健脾燥濕的佩蘭、黃連、苦參，養陰清熱的知母、地骨皮等，補益肝腎的制首烏、山茱萸等中藥配制而成，適用于糖尿病辯證屬氣陰兩虛患者。在糖尿病及其并發癥防治方面的機制涉及：通過降糖、調脂、抗氧化應激、抗炎等減輕胰島素抵抗，保護胰島β 細胞，改善胰島微循環及調控自噬［8］。通心絡膠囊由益氣扶正的人參，以蟲類通絡藥物為特點的水蛭、全蝎、土鱉蟲、蜈蚣，以及降香、冰片等組成，具有益氣、活血、化瘀通絡等功效。大量實驗已證實，通心絡具有降脂、抗炎、保護內皮細胞、抑制內皮細胞凋亡、穩定斑塊、解除痙攣、保護心腦血管組織等作用［9-10］。將“運脾津”與“通脈絡”聯合應用可使“津自生，力自達，脈絡通”，共同達到標本兼治之目的，目前已廣泛應用于臨床。丁英俊等［11］研究發現，通心絡聯合津力達能調節DN 大鼠體內血脂水平，改善腎功能并減輕腎組織病理損害程度，從而延緩DN 的發病和進展，且兩藥聯用效果更佳。

Figure 6.The levels of apoptosis-related proteins determined by Western blot.Mean±SD. n=3.△P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs HG group；#P＜0.05 vs TXL group；▲P＜0.05 vs JLD group.圖6 各組RMECs中PERK、p-PERK、GRP78、CHOP、caspase-12和Bcl-2蛋白相對水平的比較

腎小球內皮細胞，即RMECs，是腎小球濾過屏障的組成成分之一，其結構和功能損傷與蛋白尿的產生相關，也是各類腎臟疾病的始動因素［12-13］。長期慢性高血糖環境可刺激腎臟多種活性物質生成，如晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）、ROS、血管內皮細胞生長因子（vascular endo?thelial growthfactor，VEGF）等，影響內皮細胞正常的分泌功能，增加內皮細胞通透性，甚至引起內皮細胞凋亡，最終引起腎小球高濾過乃至腎小球硬化。ERS 參與機體穩態的維持，短暫的ERS 對機體而言是一種保護性反應，而高糖環境下持續存在的ERS則可誘導內皮細胞凋亡，參與DN 的發生發展［14-15］。在ERS 過程中，PERK 和內質網分子伴侶GRP78 是ERS 主要通路，GRP78 與 PERK 分離后，解離的PERK 發生二聚體化和自身磷酸化，變成有活性的PERK，誘導CHOP 的產生，從而促進細胞凋亡，CHOP 是細胞從促生存信號轉向促死亡信號的一個關鍵性元件［16-17］。此外，caspase-12 存在于內質網外膜，是介導ERS 凋亡的特異性關鍵分子，在線粒體凋亡途徑中不被活化［18］，而僅在ERS 狀態下被激活并進一步磷酸化激活下游的凋亡執行因子caspase-3，從而獨立地介導細胞凋亡［19］。ERS 在初始階段通過激活需肌醇酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）和轉錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）的表達，促進CHOP 的轉錄和翻譯，使促凋亡蛋白Bax 和Bak 表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調，從而加劇細胞凋亡［20］。其中，ROS是高血糖啟動腎臟細胞ERS 的關鍵，ROS 產生增加使腎臟抗氧化劑和膜蛋白合成增加，從而修復氧化應激反應造成損傷［21］。位庚等［22］在大鼠心肌微血管細胞中觀察到通心絡可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制同型半胱氨酸誘導的ERS，保護心肌細胞。

本研究發現津力達和通心絡均能使高糖誘導的RMECs 活力增強，且津力達聯合通心絡組上調幅度更大。我們進一步采用流式細胞術檢測高糖誘導的RMECs 凋亡率，發現津力達和通心絡單獨使用均能降低細胞凋亡率，與各單用組比較，津力達聯合通心絡組降低凋亡率更明顯，說明兩者聯合應用效果優于單藥，能更好地保護RMECs，延緩腎臟病變。此外，高糖環境下的RMECs 產生ROS 增加，津力達和通心絡處理后高糖誘導的內皮細胞ROS 生成減少，津力達聯合通心絡組ROS 下降更明顯。同時，我們的Western blot 結果提示，津力達和通心絡對ERS 相關蛋白 PERK、p-PERK、GRP78 和 CHOP 均有調控作用。高糖誘導的RMECs 中PERK、p-PERK、GRP78、CHOP 和caspase-12 的蛋白水平增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下降，提示高糖環境可引起ERS 反應持續存在，激活凋亡相關途徑。津力達、通心絡及兩者聯合應用均可降低 PERK、p-PERK、GRP78、CHOP 和caspase-12 的蛋白水平，升高Bcl-2 蛋白表達，且聯合用藥組效果更佳。

綜上所述，脈絡學說指導下通絡代表方藥津力達和通心絡能抑制高糖培養的RMECs 氧化應激及ERS 水平，且聯合應用效果優于單藥，表明其可能對DN 大鼠腎臟有保護作用，有助于延緩DN 進展。這為臨床用藥提供了實驗數據支持。氧化應激和ERS在病理環節中互為因果，有關津力達和通心絡抑制氧化應激及ERS的具體機制仍待進一步研究。