煙酸經LXRα/NPC1途徑促進巨噬細胞溶酶體膽固醇外流*

楊 萍，張漢斌，劉鈺林，方淑香，李 平，許小洋△

（廣州醫科大學 1第二臨床學院，2基礎醫學院，廣東廣州511436）

在動脈粥樣斑塊的形成過程中，巨噬細胞對膽固醇攝取、代謝及排出這一穩態機制的破壞是導致其轉化成泡沫細胞，進而促進動脈粥樣斑塊形成的關鍵環節［1-3］。現有的研究結果表明，在動脈粥樣斑塊的泡沫細胞中，過量膽固醇蓄積在溶酶體中［4-5］，提示巨噬細胞溶酶體膽固醇的調節異常是導致泡沫細胞形成、進而促進動脈粥樣硬化產生的關鍵環節。

溶酶體瞬時感受器電位黏脂蛋白1（transient re?ceptor potential mucolipin 1，TRPML1）鈣通道或尼曼-皮克C1 蛋白（Niemann-Pick C1 protein，NPC1）膽固醇轉運體缺陷，可造成以溶酶體脂質蓄積為特征的溶酶體貯積癥［6-7］，與動脈粥樣硬化斑塊的病理特征非常相似。已有報道顯示，煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate，NAADP）可促進 Ca2+經 TRPML1 通道釋放［8］，提示NAADP 有可能通過抑制溶酶體膽固醇蓄積，進而抑制泡沫細胞的形成，但其詳細的信號機制目前尚不甚明了，已有少數報道提示肝X 受體α（liver X re?ceptor α，LXRα）可能在此機制中起一定作用［9-10］。

鑒于NAADP 及NPC1 在溶酶體中膽固醇轉運中的重要作用，本研究從NAADP 合成底物——煙酸（nicotinic acid，NA）入手，觀察其對巨噬細胞溶酶體膽固醇外流的影響，并對此過程中LXRα 和NPC1 所起的作用進行了探討，以期為闡明巨噬細胞在動脈粥樣硬化中的作用機制提供更多的實驗支持。

材料和方法

1 材料

人單核-巨噬細胞株THP-1 購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購 自 Gibco；LXRα小 干 擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、NPC1siRNA 及大鼠抗人β-actin 和溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein 1，LAMP1）抗體購自Santa Cruz；siRNA 轉染試劑盒購自SignaGen；煙酸購自Sigma；實時熒光定量PCR試劑盒購自Qiagen；Alexa Fluor 633標記的山羊抗大鼠IgG（H+L）購自Thermo Fisher；細胞培養玻片（8 室）購自Biologix；氧化型低密度脂蛋白（oxi?dized low-density lipoprotein，oxLDL）購自廣州瑞千公司；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購自Promega；filipin complex（filipin）、NAADP 拮 抗 劑trans-Ned-19（Ned-19）和 Ca2+螯合劑 BAPTA 購自Cayman；Nile red購自MCE；抗NPC1兔多抗購自Mil?lipore；BeyoECL Plus（超敏ECL 化學發光試劑盒）和DMSO 購自碧云天；HRP 標記的羊抗兔IgG 購自SouthernBiotech。

2 方法

2.1 細胞培養 本研究所用細胞系為人單核-巨噬細胞株THP-1，經PMA 誘導成巨噬細胞后使用［11］：以1×109/L 的密度將THP-1 細胞置于裝有10 mL RPMI-1640 培養基（含10%胎牛血清和2%雙抗）的T25 培養瓶內，在37℃、5%CO2的細胞培養箱內培養。待細胞到達對數生長期時，以每孔6×105個接種于6 孔板中，加入PMA（終濃度100μg/L）誘導分化48 h備用。

2.2 Ned-19 及BAPTA 處理 在NA 影響溶酶體膽固醇外流的實驗中，先加入Ned-19 或BAPTA，1 h 后加入NA，再過1 h 后加入oxLDL，48 h 后固定細胞，經破膜、LAMP1抗體標記、filipin和Nile red染色等處理以進行激光共聚焦顯微鏡觀察。在NA 影響NPC1蛋白及LXRα mRNA表達的實驗中，按上述時間依次加入Ned-19（或BAPTA）、NA 和oxLDL，24 h 后提取總 RNA 用于檢測 LXRα 的 mRNA 表達，48 h 后提取蛋白用于檢測NPC1的蛋白表達。

2.3 激光共聚焦技術檢測巨噬細胞游離膽固醇及脂質蓄積 巨噬細胞游離膽固醇和中性脂質分別通過filipin 和Nile red 熒光染色劑染色；溶酶體采用溶酶體膜表面特征蛋白LAMP1 抗體免疫標記。將誘導分化好的巨噬細胞按每室5×104個接種于8室細胞培養玻片中，經不同處理后，按已報道的方法進行固定、破膜、LAMP1 抗體標記、filipin 染色［9，12］，之后細胞用Nile red 孵育10 min，PBS洗1次后封片，用于激光共聚焦檢測。激光共聚焦掃描拍照采用LSM 510多光子激光掃描顯微鏡（Carl Zeiss），不同通道圖像采取依次掃描方式獲取以防止干擾，整個過程所有參數均保持一致。Alexa Fluor 633、filipin 和Nile red熒光成像的激發/發射波長（λEx/λEm）分別為633 nm/650～710 nm、740 nm/435～485 nm 和 514 nm/535～590 nm。熒光強度采用Image-Pro 9.1軟件（Media Cyber?netics）定量，其中filipin 熒光強度代表游離膽固醇的量，Nile red 熒光強度代表中性脂質的量。同時分析filipin 與 LAMP1 之間的共定位系數（Pearson 相關系數），以判定溶酶體中游離膽固醇的量。

2.4 Western blot 檢測NPC1 蛋白的表達 因NPC1蛋白分子量較大，故在進行蛋白表達檢測時注意個別特殊條件，其余均參照已有報道中的方法［13］，經標準的Western blot 程序完成。特殊條件為蛋白提取之后不過夜即電泳，隨即以電壓30 V于4℃環境轉膜16 h；常溫用抗NPC1抗體（濃度1∶500）孵育4 h。

2.5 RT-qPCR 檢測 LXRα 的 mRNA 表達 提取總RNA 后，按已有報道中的方法進行逆轉錄和qPCR，檢測 LXRα 的 mRNA 表達［12］。LXRα 的上游引物序列為5'-CAAGATGCAGGAGACCAGGG-3'，下游引物序列為5'-GCTGACTCCAACCCTATCCC-3'。

2.6LXRα及NPC1的 RNA 干擾實驗 采用 Gen?Mute轉染試劑盒，依照原報道中的方法［12］將LXRα及NPC1siRNA 轉染巨噬細胞。RNA 干擾效應于轉染24 h 后經 RT-qPCR 驗證。在LXRαsiRNA 影響 NPC1蛋白表達的實驗中，于轉染scrambled siRNA 和LXRαsiRNA 后 24 h 加入 NA 和 oxLDL，48 h 后提取蛋白進行 Western blot。在LXRα及NPC1siRNA 影響NA 促溶酶體膽固醇外流效應的實驗中，于轉染siRNA 后 24 h 加入 NA 和 oxLDL，再經 48 h 后固定細胞，再經破膜、LAMP1 抗體標記、filipin 和 Nile red 染色等處理以進行激光共聚焦顯微鏡觀察。

3 統計學處理

采用SigmaPlot 12.5 for Windows 進行數據統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間均數比較使用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 oxLDL 濃度依賴性地促進巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積

在細胞培養液中加入不同濃度的oxLDL 處理后，激光共聚焦結果顯示巨噬細胞游離膽固醇（藍色，filipin 染色）的蓄積逐漸增加，Image-Pro 圖片分析結果顯示藍色強度明顯增強（P＜0.05），見圖1A、B。采用LAMP1 標記溶酶體（紅色），可見oxLDL 處理后疊加圖片中的紫色（藍+紅→紫）部分增強，經Image-Pro 分析共定位系數表明，溶酶體內膽固醇的蓄積明顯增加（P＜0.05），見圖1A、C。隨著oxLDL 濃度的增加，巨噬細胞內脂滴（黃色）也明顯增多（圖1A、D）。

2 NA抑制巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積

若在巨噬細胞接受oxLDL 處理前加入不同濃度的NA，則可發現，隨著NA 濃度的增加，巨噬細胞中游離膽固醇的蓄積明顯減少（P＜0.05），見圖2A、B；共定位系數分析結果也顯示，溶酶體中游離膽固醇的蓄積逐漸降低，在NA 濃度為1～10 mmol/L 時效果顯著（P＜0.05），見圖2A、C。但NA 對巨噬細胞中脂滴的蓄積無明顯影響（圖2A）。

3 Ned-19 和BAPTA 抑制NA 減少溶酶體游離膽固醇蓄積的效應

在上一實驗的基礎上，加入NAADP 拮抗劑Ned-19或細胞內Ca2+螯合劑BAPTA，則NA 減少溶酶體游離膽固醇蓄積的效應被顯著抑制（圖3A～C），提示NA 的效應可能是通過NAADP 促進溶酶體TRPML1通道釋放Ca2+所介導。但Ned-19及BAPTA對脂滴同樣沒有明顯影響（圖3A、D）。

4 NA促進NPC1表達

Western blot 結果顯示，NA 可顯著促進 NPC1 蛋白的表達，而Ned-19 和BAPTA 則可顯著抑制NA 促NPC1 表達的效應（P＜0.05），見圖4。這提示NA 促溶酶體游離膽固醇外流的機制與其促進NPC1 蛋白表達有關。

5 NA促進LXRα的mRNA表達

RT-qPCR 結果顯示，NA 可顯著提高 LXRα 的mRNA 表達，但這種效應可被 Ned-19 和 BAPTA 明顯抑制（P＜0.05），見圖5。這種效應與NA 促進NPC1蛋白表達的效應基本一致，提示LXRα 與NPC1 之間可能有一定的聯系。

6 LXRα介導NA對NPC1表達的上調

為確定NA 促進NPC1 表達是否是經核受體LXRα 介導，我們利用LXRαsiRNA 敲減LXRα的表達，再觀察NA對NPC1蛋白表達的影響。結果顯示，LXRαsiRNA 可明顯干擾LXRα mRNA 表達（圖6A）；LXRα被siRNA 干擾后，NA 促NPC1蛋白表達的效應被顯著抑制（P＜0.05），見圖6B、C，提示LXRα 介導了NA對NPC1表達的上調。

7 敲減LXRα 和NPC1 表達明顯減弱NA 促溶酶體膽固醇外流的效應

為進一步確認NA 促溶酶體膽固醇外流效應的機制，我們利用siRNA 分別敲減LXRα和NPC1表達，觀察其對NA 減少巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積效應的影響。結果顯示，敲減LXRα和NPC1表達后，NA減少巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積的效應被明顯抑制（P＜0.05），見圖7。這進一步提示LXRα 和NPC1 在NA促進溶酶體膽固醇外流的效應中起重要作用。

討 論

Figure 1.oxLDL dose-dependently increased lysosomal free cholesterol（FC）accumulation in macrophages.Macrophages were incu?bated with oxLDL at different concentrations（20～80 mg/L）for 48 h and labelled with filipin（FC，blue），LAMP1 antibody（lysosomes，red）and Nile red（lipid droplets of cholesteryl ester，yellow）.Purple spots in the merged images represented the FC sequestered in lysosomes.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluores?cence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1；D：fluorescence intensi?ty of Nile red staining for lipid droplets（cholesteryl ester）.lm：lumen，the SI unit of luminous flux.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs 0 mg/L group.圖1 oxLDL濃度依賴性地促進巨噬細胞溶酶體中膽固醇的蓄積

巨噬細胞可通過清道夫受體A 吞噬oxLDL 并將其移至溶酶體中，在溶酶體酸性脂肪酶的作用下，ox?LDL 中的膽固醇酯被水解成游離膽固醇和脂肪酸［1，14］。游離膽固醇可經溶酶體NPC1蛋白主動轉運至細胞質中［1］，其中大部分被運送至細胞膜成為細胞膜的組成部分［15］；另一部分被運送至內質網經酰基輔酶A：膽固醇酰基轉移酶1（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT-1）催化，與脂肪酸結合酯化成膽固醇酯而儲存在胞質中；還有一部分則可通過ATP 結合盒轉運體A1/G1（ATP-binding cassette transporter A1/G1，ABCA1/ABCG1）經膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）途徑轉運至細胞外［16-19］。若膽固醇和膽固醇酯在巨噬細胞內蓄積則可使其轉化為泡沫細胞，這種現象是動脈粥樣斑塊產生的病理生理學基礎［2，20］。

NA 是抗動脈粥樣硬化的常用藥物，其藥理機制主要與其抗血脂作用有關［21］。近來發現其除了抗血脂作用外，還有其他不依賴脂質的抗粥樣硬化效應，如降低血管內皮細胞中起招募單核細胞作用的黏附分子的表達、通過激活單核巨噬細胞的NA 受體——羥基羧酸受體2（hydroxycarboxylic acid receptor 2，HCA2）而抑制單核巨噬細胞向動脈斑塊的聚集、促進ABCA1 和ABCG1 的表達以增加巨噬細胞中游離膽固醇向高密度脂蛋白的轉移等［21-24］，提示NA 的抗粥樣硬化機制廣泛。

Figure 2.NA dose-dependently inhibited the accumulation of lysosomal free cholesterol（FC）in the macrophages incubated with ox?LDL（40 mg/L）.A：confocal fluorescence images；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1（lysosome）.Mean±SD. n=6. *P＜0.05 vs oxLDL group；#P＜0.05 vs control group.圖2 NA濃度依賴性地抑制巨噬細胞溶酶體中膽固醇的蓄積

本研究發現，NA 呈濃度依賴性地降低巨噬細胞中溶酶體游離膽固醇的蓄積（即促進溶酶體游離膽固醇的外流），外流出溶酶體的游離膽固醇可經RCT途徑轉運至細胞外，從而產生抗動脈粥樣硬化的作用。NA 的這種效應可能是其抗動脈粥樣硬化的另外一條重要途徑。雖然對其促進巨噬細胞溶酶體游離膽固醇外流的機制尚不清楚，但有必要對其進行深入探討。

溶酶體膜上存在非特異性TRPML1 Ca2+通道［11］和 NPC1 膽固醇轉運體［25］。經溶酶體 TRPML1 通道的Ca2+釋放與溶酶體膽固醇轉運關系密切［26］。TRPML1突變（引起溶酶體Ca2+釋放減少）或NPC1缺陷將導致兩類溶酶體貯積癥［6-7，27］，分別為 IV 型黏脂貯積癥（mucolipidosis type IV）［28］和 C1 型尼曼-皮克病（Niemann-Pick disease type C1）［29］，二者均與動脈粥樣斑塊的病理特征非常相似，其本質均為溶酶體脂質轉運功能紊亂。

已有報道表明，NAADP 可促進Ca2+經TRPML1通道釋放［8］，提示其可能參與溶酶體膽固醇的調節。本研究中NA 作為NAADP 生成的底物（由ADP 核糖基環化酶CD38催化NADP+與NA 反應產生），其減少巨噬細胞中游離膽固醇蓄積的效應可能與NAADP促TRPML1釋放Ca2+的作用密切相關，而后者也可能通過某種途徑參與了NPC1功能的調節，影響巨噬細胞溶酶體膽固醇代謝。

為此，本研究觀察了NAADP 拮抗劑Ned-19 及Ca2+螯合劑BAPTA 對NA 促溶酶體游離膽固醇外流效應的影響。結果表明二者均可顯著抑制NA 的上述效應，提示NA 的效應可能是通過增加NAADP 合成，進而促進溶酶體TRPML1 通道釋放Ca2+所導致。這與我們原來的報道相一致，即NAADP 合成酶CD38基因敲除的小鼠，經高脂飲食后冠狀動脈出現明顯的粥樣斑塊，且該部位巨噬細胞溶酶體中膽固醇的蓄積明顯升高［12］。

如前所述，溶酶體膜上的NPC1膽固醇轉運體與其膽固醇調節密切相關，NA 促進TRPML1 釋放的Ca2+可能通過某種機制影響NPC1的表達而促進溶酶體中游離膽固醇的外流。因此，我們進一步觀察了NA、NAADP 拮抗劑 Ned-19 及 Ca2+螯合劑 BAPTA 對NPC1蛋白表達的影響，發現NA可顯著促進NPC1蛋白表達，此效應可被Ned-19 和BAPTA 所抑制，提示NA 的效應與其通過NAADP 促進TRPML1 通道釋放Ca2+，進而上調NPC1蛋白表達有關。

Figure 3.NAADP antagonist Ned-19 and calcium chelator BAPTA attenuated the effect of NA on lysosomal free cholesterol（FC）ac?cumulation.Macrophages were incubated with oxLDL at 40 mg/L in the presence of NA（5 mmol/L）combined with Ned-19（100 μmol/L）or BAPTA（5 μmol/L）for 48 h and labelled with filipin（FC，blue），LAMP1 antibody（lysosomes，red）and Nile red（lipid droplets of cholesteryl ester，yellow）.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1；D：fluorescence intensity of Nile red staining for lipid droplets（cholesteryl ester）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NA+oxLDL group.圖3 NAADP拮抗劑Ned-19和鈣離子螯合劑BAPTA抑制NA對溶酶體膽固醇蓄積的效應

而經TRPML1 通道釋放的Ca2+通過何種途徑促進NPC1蛋白表達，目前尚不清楚。曾有報道顯示核受體 LXRα 是 NPC1 表達上調的重要信號因子［30］。為此，本研究繼續觀察了NA、Ned-19 及BAPTA 對LXRα mRNA 表達的影響。結果顯示，NA 可顯著提高 LXRα 的 mRNA 表達，這一效應亦可被 Ned-19 和BAPTA顯著抑制；而當敲減LXRα基因表達后，NA促NPC1 蛋白表達的效應被顯著抑制。這部分結果與已有的報道和我們近期發表的結果相一致［9-10，30］，提示NA促NPC1表達的效應由LXRα介導。

為進一步確認LXRα 和NPC1 在巨噬細胞溶酶體膽固醇外流中的作用，本研究利用RNA 干擾技術分別敲減LXRα和NPC1的表達，結果顯示 NA 減少巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積的效應被明顯抑制。這進一步證實LXRα 和NPC1 在NA 促進溶酶體膽固醇外流的效應中起關鍵作用。

Figure 4.NA promoted NPC1 protein expression in oxLDL-loaded macrophages.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 NA促進oxLDL處理的巨噬細胞中NPC1蛋白的表達

Figure 5.NA promoted mRNA expression of LXRα in oxLDL-loaded macrophages.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group.圖5 NA 促進oxLDL 處理的巨噬細胞中LXRα mRNA 的表達

由于本實驗的研究對象是基于人單核細胞白血病細胞誘導的巨噬細胞，雖然相對于動物原代培養細胞而言更接近于人類本身，但所有研究工作均是在細胞水平開展的，因此，今后如能結合人類的臨床標本或臨床數據，則可取得更具影響力的數據。此外，本研究結果顯示，NA 對巨噬細胞中的脂滴無明顯影響，其中機制還有待闡明。

Figure 6 The effect of NA on NPC1 protein expression was abolished by LXRα siRNA in oxLDL-loaded macro?phages.The macrophages were transfected with 20μmol/L scrambled siRNA or LXRα siRNA，and 24 h after transfection，they were incubated with 40 mg/L of oxLDL in the presence of 5 mmol/L NA for 48 h.A：the mRNA expression of LXRα 24 h after transfec?tion was detected by RT-qPCR to evaluate the inter?ference efficiency of LXRα siRNA；B：the protein level of NPC1 after NA+oxLDL treatment for 48 h was determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs scrambled siRNA.圖6 LXRα siRNA消除NA對NPC1表達的作用

綜上所述，NA 可顯著促進溶酶體膽固醇外流，這可能是NA 抗動脈粥樣硬化的另外一條重要途徑，其機制可能是：NA 增加NAADP 的生成，進而促進TRPML1 通道 Ca2+的釋放，后者以核受體 LXRα 為介導，上調NPC1 蛋白表達，最終促進溶酶體膽固醇外流。至于Ca2+以LXRα 為介導上調NPC1 蛋白表達的詳細機制，仍有待后續進一步研究。

Figure 7.The effect of NA on lysosomal free cholesterol（FC）accumulation was abolished by LXRα siRNA（siLXRα）and NPC1 siRNA（siNPC1）in oxLDL-loaded macrophages.A：confocal microscopic images of filipin，LAMP1 and Nile red staining；B：fluorescence intensity of filipin staining for FC；C：colocalization coefficient between filipin and LAMP1.Scr：Scram?bled siRNA.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NA+oxLDL group or Scr+NA+oxLDL group.圖7 LXRα siRNA和NPC1 siRNA抑制NA促溶酶體游離膽固醇外流的效應