NKT細胞通過下調PDGFRβ抑制Ang II誘導的小鼠血管平滑肌細胞表型轉換*

肖 雪，侯翠柳，王筱筱，陳立瑞，楊 慧，田 翠，王紅霞△

（首都醫科大學基礎醫學院 1生理與病理生理學系，2病理學系，北京100069）

高血壓是心血管疾病重要的危險因素之一，其患病率逐年升高［1］。高血壓病的顯著病理特征之一為血管重塑，其中血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的表型轉換在血管重塑中起著重要的作用［2］。已有動物實驗證實，VSMCs 在血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）等因素的作用下可發生表型轉換，表現為收縮型VSMCs 標志蛋白［如α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）］表達減少，而分泌型VSMCs 標志蛋白［如骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、細胞外基質和炎癥因子］表達增加，進而引起血管重塑［3-4］，但引起表型轉換的機制尚不完全清楚。有研究顯示，血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）可抑制VSMCs收縮型標志物的表達，使其由收縮型轉換為分泌型［5］，在血管重塑的發生中具有重要的調節作用。

CD1d 依賴的自然殺傷T 細胞（natural killer T cells，NKT 細胞）是一種新型的T 細胞亞群。不同于傳統的T 細胞，NKT 細胞只識別由細胞膜蛋白CD1d提呈的糖脂類抗原，CD1d基因的敲除則導致NKT 細胞無法激活［6］。α-半乳糖神經酰胺（α-galactosylce?ramide，α-GC）為NKT 細胞最經典及活性最強的外源性配基，它可與CD1d 結合而形成穩定的CD1d-糖脂共價結合物，從而激活 NKT 細胞［7］。NKT 細胞被激活后可分泌大量促炎細胞因子［如干擾素γ（inter?feron-γ，IFN-γ）、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等］及抗炎細胞因子（如IL-4、IL-5、IL-10 等）來調節其它免疫細胞（如樹突狀細胞、T 細胞及B 細胞）的激活，因此NKT 細胞被認為是聯系先天和獲得性免疫的“橋梁”［6］。有研究證實，NKT 細胞參與多種心血管疾病的發生，如其激活可減輕心肌缺血/再灌注損傷［8］、梗死后心肌重塑及心衰等［9］。我們前期研究的結果顯示，NKT 細胞失活可加重高血壓引起的心臟損傷及心肌重塑［10］，還可加重Ang II 灌注引起的血壓升高及血管損傷，但其是否影響VSMCs表型轉換，目前尚不清楚。

本研究在CD1d基因敲除（CD1dgene knockout，CD1d-KO）小鼠及給予 α-GC 的野生型（wild-type，WT）小鼠上，給予Ang II 灌注，觀察NKT 細胞失活及激活對血壓、血管重塑及主動脈組織平滑肌細胞表型轉換的影響，并檢測PDGFβ 表達的變化，探討其在血管重塑中的作用及機制。

材料和方法

1 實驗動物

選取 6～8 周 SPF 級 C57BL/6J 雄性 WT 小鼠，體重20～25 g，購買于北京維通利華公司。CD1d-KO 小鼠購自Jackson Laboratory。所有實驗動物均于首都醫科大學SPF 級實驗動物房飼養和繁殖。所有研究工作均遵守美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）制定的《實驗動物管理及使用指南》，并經首都醫科大學實驗動物管理委員會批準。

2 主要試劑

Ang II（A9525）和三溴乙醇（T48402）均購于Sig?ma；RIPA 裂解液（R0010）購于索萊寶公司；α-GC（KRN7000）購于Funakoshi；PVDF 膜（ISEQ00010）購自 Immobilon；抗 α-SMA 抗體（sc-53142）購于 Santa Cruz 生物公司；抗 OPN 抗體（22952-1-IP）購于 Pro?teintech；抗PDGFRβ 抗體（ET1605-20）購于杭州華安生物技術有限公司；鼠源（7076P2）及兔源（7074P2）II抗購于Cell Signaling Technology。

3 主要方法

3.1 實驗分組 （1）NKT 細胞失活實驗：將WT 小鼠及CD1d-KO小鼠隨機分為4組（每組5～8只），分別為對照組（WT+saline 組和CD1d-KO+saline 組）及實驗組（WT+Ang II 組和CD1d-KO+Ang II 組）。對照組小鼠給予生理鹽水，實驗組給予490 ng·kg-1·min-1劑量的Ang II，緩釋泵持續灌注 14 d。（2）NKT 細胞激活實驗：將WT小鼠隨機分為4組（每組5～8只），分別為對照組（WT+saline 組和WT+α-GC 組）及實驗組（WT+Ang II組和WT+Ang II+α-GC組）。

3.2 模型制備 本實驗對C57BL/6J 小鼠灌注Ang II（490 ng·kg-1·min-1）引發高血壓反應，從而制備小鼠高血壓模型［11］，使用Alzet緩釋泵灌注14 d，間斷監測血壓，血壓≥140 mmHg 即為模型制備成功。小鼠稱重，計算所需Ang II 劑量，泵速0.25 μg/h，每只泵體積100 μL，于超凈臺下灌泵，37℃孵育4～6 h 或過夜。小鼠用3%的三溴乙醇溶液腹腔麻醉，常規消毒實驗組小鼠耳后皮膚，剪開約1 cm長的切口，將泵埋入淺筋膜下層，泵開口朝向小鼠尾部。縫合皮膚，待小鼠生命體征平穩后送回鼠房飼養14 d，間斷尾套法監測小鼠血壓。從埋泵前一天開始，以100μg/kg的劑量隔天腹腔注射α-GC。

3.3 血管取材 將小鼠麻醉并固定于操作板上，打開胸腔后用肝素生理鹽水灌注心血管循環系統，剪取分離小鼠主動脈。用于提取總蛋白的組織用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱；用于病理檢查的組織固定于4%甲醛中，之后用石蠟包埋切片，脫蠟后進行HE和Masson染色。

3.4 Western blot 實驗 將小鼠主動脈組織在RIPA裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）中剪碎，勻漿，用超聲波細胞破碎儀低溫裂解細胞，4℃、16 000×g離心15 min，取上清，BCA 法測定蛋白濃度。每組動物組織取50μg總蛋白經SDS-PAGE 分離，電轉至PVDF 膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，I抗4℃孵育過夜，次日洗滌 I 抗 3 次，孵育 II 抗 1 h，洗滌 II 抗 4 次，化學發光法顯影。

4 統計學處理

采用SPSS 軟件進行統計分析。數據以均數±標準誤（mean±SEM）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CD1d敲除加重Ang II灌注引起的血壓升高

與對照組（WT+saline 組）相比，灌注Ang II 后小鼠血壓顯著升高（P＜0.05），而CD1d敲除（NKT 細胞失活）則加重Ang II 灌注引起的血壓升高（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Effect of Ang II infusion for 14 d on blood pressure of WT and CD1d-KO mice.Mean±SEM. n=8.*P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖1 無創尾套法檢測Ang II 灌注14 d 后WT 及CD1d-KO小鼠的血壓變化

2 CD1d 敲除加重Ang II 灌注引起的血管重塑，而NKT細胞激活則減輕上述改變

與WT+saline 組相比，Ang II 灌注引起小鼠血管壁增厚，膠原沉積增多，纖維化明顯，CD1d敲除加重了Ang II灌注引起的上述變化（P＜0.05），見圖2A；而給予NKT 細胞特異性激活劑α-GC 則減輕了上述改變（P＜0.05），見圖2B。

3 CD1d 敲除加重Ang II 灌注引起的VSMCs 表型轉換

與WT+saline 組相比，Western blot 結果顯示Ang II灌注顯著減少小鼠VSMCs 收縮型標志蛋白α-SMA的表達（P＜0.05），增加小鼠VSMCs 分泌型蛋白OPN的表達（P＜0.05）；CD1d敲除后上述改變進一步加重（P＜0.05），見圖3。

4 NKT 細胞激活減輕Ang II 灌注引起的VSMCs表型轉換

與 Ang II 組相比，灌注 Ang II 同時給予 α-GC 可顯著增加α-SMA 的表達（P＜0.05），減少OPN 的表達（P＜0.05），見圖4。

5 NKT 細胞通過影響PDGFRβ 的表達而參與Ang II灌注引起的VSMCs表型轉換

與WT+saline 組相比，灌注Ang II 后小鼠主動脈組織中PDGFRβ表達顯著增加，CD1d敲除進一步增加 PDGFRβ 的表達水平（P＜0.05），而 α-GC 則降低PDGFRβ的表達（P＜0.05），見圖5。

討 論

在本研究中，我們證實了NKT 細胞失活可進一步加重Ang II 灌注引起的小鼠VSMCs 表型轉換，進而加重血管重塑，且進一步上調小鼠動脈組織中PDGFRβ 的表達水平，而NKT 細胞特異性激動劑α-GC 可以顯著減輕以上改變，從而提示NKT 細胞可能通過影響PDGFRβ表達參與VSCMs的表型轉換。

既往研究證實，VSMCs表型轉換是高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的細胞病理學基礎［12］。當血管受到刺激之后，收縮型VSMCs去分化轉換為具有較強分泌能力及增殖能力的分泌型VSMCs 來適應環境變化，可分泌細胞外基質蛋白引起血管壁增厚，進而引起血管重塑［3］。Guzik 等［13］的研究顯示，缺乏T 細胞和B 細胞的RAG-1-/-小鼠具有遲鈍的高血壓反應，過繼轉移T細胞而不是B細胞恢復了小鼠對高血壓刺激因素的正常反應，并且在給予小鼠Ang II 后檢測到血管中的T 細胞表面標志物CD3及T細胞受體顯著增加，證明T細胞在高血壓的病理生理進程中具有重要作用。有研究顯示，自發性高血壓大鼠血管組織中收縮蛋白α-SMA 下調，而合成蛋白OPN 上調，表明在高血壓發生與發展的過程中發生了VSMCs的表型轉換［14］。我們之前的結果也顯示，Ang II顯著增加小鼠動脈組織炎癥細胞的浸潤，而作為先天與獲得性免疫的“橋梁”的NKT 細胞失活后進一步增加炎癥細胞在小鼠動脈組織的聚集，這些結果提示NKT細胞參與了高血壓的發生，其激活后可拮抗高血壓的發展［15］，但NKT 細胞是否參與高血壓引起的VSMCs表型轉換尚不清楚。本研究結果顯示，NKT 細胞失活可進一步下調Ang II 灌注引起的收縮型蛋白α-SMA 的表達，上調分泌型蛋白OPN的表達，而NKT細胞激活則減輕上述變化，提示NKT 細胞作為一種新型的T 細胞亞群，也參與了高血壓小鼠的VSMCs表型轉換及血管重塑。

Figure 2.Effects of NKT cell inactivation（CD1d-KO；A）and activation（α-GC treatment；B）on Ang II-induced remodeling of aor?tic tissues.The vascular wall thickness was measured by HE staining，while collagen deposition was observed by Masson staining.Scale bar=50 μm.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖2 HE和Masson染色檢測CD1d敲除及NKT細胞激活對Ang II灌注引起的血管重塑的影響

Figure 3.Effects of CD1d-KO（NKT cell inactivation）on OPN and α-SMA protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖3 CD1d敲除對灌注Ang II后主動脈組織中OPN和α-SMA表達的影響

Figure 4.Effects of α-GC（NKT cell activation）on OPN and α-SMA protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5.*P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖4 NKT細胞激活對灌注Ang II后主動脈組織中OPN和α-SMA表達的影響

Figure 5.Effects of CD1d-KO（NKT cell inactivation）and α-GC（NKT cell activation）on PDGFRβ protein expression in aortic tissues after Ang II infusion.Mean±SEM. n=5. *P＜0.05 vs WT+saline group；#P＜0.05 vs WT+Ang II group.圖5 CD1d敲除及NKT細胞激活對灌注Ang II后主動脈組織中PDGFRβ表達的影響

有研究顯示，PDGF 可抑制VSMCs 收縮型標志物的表達，表明PDGF 調節VSMCs 去分化且促進了其由收縮型向分泌型轉換［5，12］。PDGF 是脈管系統遷移和增殖的發育過程中所必需的一種重要的促有絲分裂因子，可形成二聚體結構如PDGF-AA 和PDGFBB，與細胞膜上的相應受體PDGFRα 和PDGFRβ 結合后具有刺激特定細胞群分裂、增殖的能力［16］。蔣健等［17］的研究發現，血管緊張素轉換酶抑制劑通過下調PDGF 的表達抑制VSMCs 表型轉換，進一步驗證了PDGF 在VSMCs 表型轉換中的重要作用。本研究顯示，CD1d敲除進一步促進Ang II 灌注引起的PDGFRβ 表達上調，而給予 α-GC 減輕 Ang II 灌注引起的上述變化，提示NKT 細胞可能是通過調節小鼠主動脈組織中PDGFRβ的表達來調節VSMCs的表型轉換，從而參與血管重塑的發生。

綜上所述，NKT 細胞失活可加重Ang II 灌注引起的血壓升高、血管重塑及VSMCs表型轉換，上調血管組織中PDGFRβ 的表達，而NKT 細胞激活則減輕上述變化。以上結果提示NKT 細胞可能通過影響PDGFRβ 的表達，從而調節VSMCs 表型轉換，參與血管重塑。