通過顯微介導將鱖總DNA 片段導入鏡鯉基因組的分子驗證

閆學春，欒培賢，何立川

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，淡水魚類育種國家地方聯合工程實驗室，淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

魚類遠緣雜交（distant hybridization）是對舊物種的改良和新物種的創造等重要魚類育種途徑之一[1]，目前，已在魚類的雜種優勢、抗寒育種、單性雜種、多倍體、提高起捕率、誘發雌核發育、抗病育種和誘發雄核發育等方面取得了進展[2-9]。但其不足就是雜交不易成功，種間隔離造成雜種不育，嚴重限制了遠緣雜交親本的選擇范圍。而顯微介導遠緣雜交技術可以彌補遠緣雜交的不足。利用顯微注射技術，將外源基因組DNA 轉化到受體，是將經過改良的新的性狀或相關性狀直接轉化受體的方法，克服了基因差異和生理差異所造成的遠緣雜交原代不親和和后代不育等障礙，最終實現直接進行外源DNA 水平的片段雜交[10-13]。但其檢測方法不能用魚類轉單個基因中一些常用的外源基因整合鑒定和表達檢測等技術，因為導入的外源總DNA 沒有明確的分子標記和一致的序列結構。而使用擴增片段長度多態性（AFLP）技術不需要預先知道被研究魚類的DNA 序列信息，在受體基因組中，通過檢查擴增目的DNA 片段的有無，來找到外源總DNA 轉化的分子證據，因此，AFLP 技術是一個快速檢測總DNA 的好方法。有關AFLP 技術在魚類總DNA 檢測方面已有過報道[14-17]。

鱖Siniperca chuatsi 肉味鮮美，營養豐富，富含人體必需的氨基酸和鈣、鉀、鎂、硒等營養元素，是一種名貴的肉食性淡水養殖魚類。鏡鯉Cyprinus carpio 生長快，是一個多棲息水域中下層的常規淡水雜食性魚類。目前，已選育出適合池塘養殖的德國鏡鯉選育系，也是主要的池塘鯉養殖品種之一[18-20]。本研究通過顯微介導的遠緣雜交技術，將未經遺傳修飾的親緣關系甚遠的優異鱖基因組DNA 導入受體鏡鯉中，通過這種基因組水平的超遠緣雜交技術，改善鏡鯉的肌肉品質；用AFLP 方法檢測顯微介導鱖基因鏡鯉，驗證了在受體親本的基因組中整合了供體基因片段，再將與鱖相同的AFLP 條帶進行切下、回收、測序，測序結果表明，供體鱖片段序列與顯微介導的鱖鏡鯉片段序列完全一致，進一步明確了外源基因組DNA 轉化的分子證據。而顯微介導外源總DNA 轉化，為鯉科魚類肌肉品質的改良，為魚類遠緣、超遠緣物種間的基因交流提供了有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供體基因是鱖總DNA。實驗魚取自本課題組生產的顯微介導的鱖基因鏡鯉，顯微注射用的鏡鯉受精卵取自黑龍江水產研究所呼蘭試驗站。

1.2 方法

1.2.1 鱖基因組DNA 的提取

用2mL 無菌一次性注射器，在鱖的尾部采新鮮血液10～15μL，加入含有400μL 裂解液的1.5mL 離心管中，混勻，裂解液為100mM EDTA，pH=8.0。放入55℃水浴消化1h 左右，期間將離心管顛倒幾次混勻，待溶液清澈透明后，取出離心管，加入等體積的體積比為酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1 的混合液，緩慢來回顛倒離心管15min，10000r/min 離心6min。另取一個干凈離心管裝入上層液體，加入2倍體積預冷的無水乙醇（沉淀DNA），混勻，-20℃處理2h，離心，沉淀加70%乙醇洗滌離心，加100μL TE（tris-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）溶解。

1.2.2 外源基因的導入

在繁殖季節，采集高質量的卵子和精子進行人工受精，利用外源基因的導入技術，將未經遺傳修飾的鱖基因組DNA 導入鏡鯉受精卵的核區附近，注射量為1nL 左右。共導入2500 余粒鏡鯉受精卵，孵出仔魚1500 余尾，放入池塘300 尾正常飼養。

1.2.3 顯微介導鱖基因鏡鯉DNA 提取

取新鮮的鰭條，盡量剪碎裝入1.5mL 離心管中，加入裂解液，消化，等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液抽提，預冷的無水乙醇沉淀，TE 溶解。具體實驗魚DNA 提取參見閆學春[21]。

1.2.4 AFLP 反應體系的建立

1.2.4.1 酶切連接

本實驗選用了兩種酶Mse I 和EcoR I 的酶切組合研究酶切效果。酶切總體系20μL，其中10×Buffer 2μL，BSA 0.2μL，模板DNA 400ng，Mse I 0.5μL，EcoR I 0.5μL，補ddH2O 至終體積20μL，混勻，37℃水浴2h，65℃滅活20min，終止酶切反應，冰浴。連接體系：在裝有酶切產物的離心管中，依次加入Mse I 接頭1μL、EcoR I 接頭1μL、T4-DNA 連接酶0.5μL、連接酶Buffer 1μL，補ddH2O 至終體積30μL。過夜連接。

1.2.4.2 預擴增

在加有1μL 連接產物的試管中加入EcoRⅠ引物1μL、Mse I 引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.1μL 和Buffer 14.4μL，加水至20μL?；靹蚝?，按如下PCR 擴增 條 件：94℃變 性30s，56℃退 火1min，72℃延 伸1min，20 個循環，完成循環后再延伸6min（72℃）。

1.2.4.3 選擇性擴增

建立25μL 選擇擴增反應體系：加入稀釋10 倍的預擴增產物1μL、MseⅠ選擇擴增引物1μL、EcoRⅠ選擇擴增引物1μL、Taq DNA 聚合酶0.3μL 和Buffer 18μL，加水至25μL。混勻后，按如下PCR 條件擴增：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸60s，進行36 個循環，其中13 個循環后，每個循環復性溫度降低0.7℃。

表1 AFLP 接頭及引物序列Tab.1 Adapters and primers sequences of AFLP

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

選擇擴增產物中加入等體積上樣緩沖液（去離子甲酰胺98%、10 mmol/L EDTA、0.25%溴酚藍和0.25%二甲苯青），混勻，94℃變性10min 后，立刻冰浴冷卻待用。取5μL 變性后的樣品，6%的變性聚丙烯酰胺凝電泳檢測，55W 恒定功率電泳，電泳約2.5h。取下膠板固定，銀染[22，23]，照相，分析。

1.2.4.5 目的條帶回收測序

PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將差異性條帶回收，測序。

2 結果與分析

2.1 顯微介導鱖基因鏡鯉基因組DNA 提取

采用酚/氯仿混合提取方法提取的顯微介導鱖基因鏡鯉基因組DNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因組DNA 條帶清晰無彌散。DNA 定量分析儀分析表明，提取的基因組DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，表明蛋白質、RNA 等雜質含量極少，提取的顯微介導鱖基因鏡鯉基因組DNA 純度高，符合AFLP 的后續實驗要求[24]（圖1）。

2.2 AFLP 擴增結果

利用引物E-AGG，M-CTA，對顯微介導鱖基因鏡鯉基因組DNA 進行AFLP 檢測，以鱖基因組DNA 為陽性對照，普通鏡鯉基因組DNA 為陰性對照。在AFLP 的15 對引物中，在顯微介導鱖基因鏡鯉中有3 對引物均擴增出了供體鱖基因片段，在基因水平上驗證了在受體親本的基因組中已整合了供體鱖基因片段（表1、圖2）。

2.3 產物回收測序結果

為進一步找到遺傳證據，將與鱖相同的AFLP條帶進行切下、回收、測序。測序結果表明，供體鱖片段序列與顯微介導鱖基因鏡鯉片段序列完全一致（圖3）。

3 討論

AFLP 是第三代分子標記技術，綜合了限制性酶切片段多樣性（RFLP）和聚合酶鏈式反應（PCR）的優點，分析結果靈活性高，穩定可靠，多態性豐富，不需要預知基因組的序列特征，適用于任何來源和各種復雜度的DNA[25]。自AFLP 技術問世以來，已廣泛應用于遺傳連鎖圖譜的構建、種質分析、遺傳分析、指紋多態性和外源基因檢測等方面。王朝溪等[26]利用AFLP 技術分析了青海湖裸鯉Gymnocypris przewalskii 群體間的遺傳差異，構建了其擴增片段長度多態性的指紋圖譜，研究結果為青海湖裸鯉的多樣性檢測和親本選育提供了可靠的技術參數，對青海湖裸鯉資源庫積累具有指導意義。嚴駿驄等[27]運用AFLP 技術從3 個層面分析了鰱Hypophthalmichthys molitrix 的土著群體、中國土著群體內和海外移居群體的遺傳格局，結果表明3 個群體間的分化表現顯著，為鰱的種質資源利用、保護和管理積累了基礎資料。王志勇等[28]分析了官井洋大黃魚Larimichthys crocea 指紋多態性的AFLP，為大黃魚種質優化提供了依據。Young 等[29]構建了虹鱒Oncorhynchus mykiss 遺傳連鎖圖譜，利用476 個AFLP 分子標記進行了遺傳連鎖分析，得到主連鎖群32 個，小連鎖群11 個。佟廣香等[30]報道了利用AFLP 技術檢測了轉基因鯉Cyprinus carpio，證明了與生態安全直接相關的是轉基因鯉逃逸的數量。閆學春等[16]報道了通過AFLP 的檢測與分析，驗證了河蟹Eriocheir sinensi 總DNA 可通過顯微介導方式整合到鏡鯉基因組中，這與本研究結果一致。本研究建立了顯微介導鱖基因鏡鯉的AFLP 反應體系，適合本研究顯微介導鱖基因鏡鯉的鑒定，其原理是先通過限制性內切酶將顯微介導鱖基因鏡鯉的基因組DNA 雙酶切后，再通過將特定的接頭鏈接在其分子量大小不等的限制性酶切片段的兩端，對鏈接有特定接頭的片段進行擴增，先進行預擴增，再進行選擇擴增，因變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率較高，所以對選擇性擴增產物在變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，通過條帶的多少，而獲得DNA 的多態性，進而尋找實驗所需要的特異條帶，再通過電泳圖譜查找是否含有供體基因片段。如果有供體基因片段，就證明了受體基因組中已成功整合了供體基因片段，其結果證明了AFLP 方法是檢測顯微介導鱖基因鏡鯉的有效工具[31，32]。

利用顯微介導遠緣雜交技術，將異源DNA 直接導入魚類進行分子育種，可以豐富魚類遺傳基礎，擴大變異類型，將傳統育種中難以利用的遠緣基因轉移，為傳統育種提供新的種質，對魚類育種工作有實踐意義[33，34]。鏡鯉和鱖在分類學上屬于兩個不同目，親緣關系較遠的物種，通過常規的育種方法很難進行雜交，主要受生物種間隔離限制而顯示了其不可回避的局限性，但通過顯微介導的方式將鱖基因組DNA 導入受體鏡鯉基因組中，可以克服常規雜交選育方法中各種雜交不親和性障礙，因此，顯微介導遠緣雜交技術在創造魚類新品種、新類型方面存在著巨大的應用前景。而利用鱖良好的遺傳資源，再結合顯微介導的遠緣雜交技術，將這些有益的基因導入受體魚中，就有可能實現對受體魚的改良。本研究通過AFLP 指紋圖譜分析，在顯微介導鱖基因鏡鯉中檢測到了鱖的特異片段，這從DNA 水平上證實了鱖的部分基因片段已滲入到顯微介導鱖基因鏡鯉親本基因組中，說明了鱖總DNA導入受體鏡鯉獲得成功。轉基因是隨機插入，至于是哪部分基因插入到受體基因組中，發揮著什么作用，還有待進一步研究。本研究是兩個基因組之間的雜交，盡管所滲入的供體基因組基因沒有轉目標基因那么明確，但只要能使受體親本的目標性狀達到改良的目的，就對鯉科魚類的肌肉品質改良具有重要有意義[13]。