茜素紅S標記鳙耳石的效果及其在增殖放流中的應(yīng)用

闕江龍，王生，萬錦濤，李涵，賀剛，張燕萍

（江西省水產(chǎn)科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部湖泊漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測試驗站，江西 南昌 330039）

目前，過度捕撈、環(huán)境污染、大型水利工程建設(shè)、江湖阻隔等因素的影響，內(nèi)陸水域生態(tài)環(huán)境發(fā)生了重大改變，漁業(yè)資源嚴重衰退，甚至枯竭。增殖放流是漁業(yè)資源養(yǎng)護的重要手段，在增加水生生物種群數(shù)量的同時，維持了生態(tài)系統(tǒng)多樣性，改善了水域生態(tài)環(huán)境[1]。但目前對放流效果缺乏系統(tǒng)評估，放流的后續(xù)管理及放流措施優(yōu)化缺乏科學依據(jù)[2]。

標志放流是評價放流效果，掌握放流魚群移動分布規(guī)律的重要途徑。近年來應(yīng)用較多的標志放流方法有切鰭法、掛牌法、金屬線碼標記及分子標記等。但這些方法或?qū)︳~體損傷較大或操作復(fù)雜等，存在一定的局限性，不適用于內(nèi)陸水域中高數(shù)量、小個體的魚種標記放流。熒光標記技術(shù)是用熒光染料浸泡魚類使染料沉積在魚類耳石、鱗片等鈣化組織上，產(chǎn)生在顯微鏡下可識別的熒光標記或著色點標記[3]。熒光染料標記方法簡單、適用范圍廣，對標記對象損傷較小，可大規(guī)模操作[4]，在漁業(yè)研究中受到越來越多的關(guān)注[5]，已在日本銀魚Argyrosomus japonicus[6]、許氏平鲉Sebastes schlegelii[7]、1 齡虹鱒Oncorhynchus mykiss 幼魚[8]、中華倒刺鲃Spinibarbus sinensis[9]、滇池金線鲃Sinocyclocheilus grahami[10]、長臀鮠Cranoglanis bouderius[11]和珊瑚魚[12]等多種魚類中研究應(yīng)用，取得了一定成效。

鳙Aristichthys nobilis（又叫胖頭魚、花鰱）為中國特有，分布水域范圍很廣，是池塘養(yǎng)殖及水庫漁業(yè)的主要養(yǎng)殖對象的大宗淡水產(chǎn)品之一，經(jīng)濟價值極高。鳙鰓耙結(jié)構(gòu)獨特，濾食浮游動植物能力較強，對氮、磷去除效果較好[13]，利用鳙治理水域富營養(yǎng)化，改善生態(tài)環(huán)境取得一定成效[14，15]。以江西省為例，僅2017—2018 年度放流的鳙夏花、冬片達1.1億尾。由于未開展規(guī)范的效果評估，全省范圍內(nèi)大規(guī)模的放流對漁業(yè)資源恢復(fù)效果及水生態(tài)環(huán)境的修復(fù)程度不能做出科學的答復(fù)，也不利于后期放流方式的完善。本文利用茜素紅S 溶液浸泡標記鳙幼魚，觀察其對鳙耳石的標記效果，尋找最佳標記濃度和浸泡時間等，以期為大規(guī)模增殖放流中個體識別及效果評價提供技術(shù)支持和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

20 日齡鳙幼魚（500 尾）來自江西省水產(chǎn)科學研究所黃馬基地，在盛有曝氣48h 的自來水玻璃缸中暫養(yǎng)1d。試驗用茜素紅S 分子式為C14H7NaO7S，中文別名為茜素磺酸鈉；茜素S；茜素紅S；茜素胭脂紅；1，2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 方法

茜素紅S 浸泡液濃度和浸泡時間見表1，設(shè)定5 個茜素紅S 標記濃度：50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L 和250 mg/L 和一個空白對照組。試驗在透明的的玻璃水族箱中進行（長30cm×寬30cm×高30cm），開始時隨機在各濃度溶液中加入25 尾鳙魚，浸泡過程中向水體中充氣，浸泡結(jié)束后將幼魚撈出，在流動清水放置半小時，最后放入清水中暫養(yǎng)并恢復(fù)投餌。

耳石的摘取和測定：將魚置于Mshot 解剖鏡（MD50）下，用解剖鑷子和解剖針快速取出耳石，蒸餾水洗滌，95%乙醇脫水，光學顯微鏡下觀察標記效果，并拍照。按照無（-）、可見（+）、明顯（++）、強烈（+++）記錄耳石熒光反應(yīng)強度[16]。

耳石生長測定：將200 尾鳙在100mg/L 茜素紅S 溶液中浸泡24h，放入網(wǎng)箱中飼養(yǎng)，每周在Mshot解剖鏡（MD50）下取耳石，測量耳石中心距邊緣短徑的長度，計算耳石的生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 茜素紅S 標記的安全濃度

由表1 可知，當茜素紅S 溶液濃度在50～150 mg/L、水溫25～28℃、浸泡時間8～24h 時，鳙幼魚成活率為100%，當濃度升至200mg/L 時，鳙幼魚全部死亡。

2.2 標記效果

表1 茜素紅標記方案和標記效果Tab.1 Alizarin red labeling scheme and labeling effect

可見光下，解剖鏡下觀察茜素紅溶液浸泡標記的鳙耳石，可見紫紅色標記環(huán)帶，標記強度與浸泡濃度和浸泡時間有關(guān)。對照組中，經(jīng)清水浸泡的鳙耳石呈透明灰質(zhì)（圖1）；8h 浸泡時間下，各濃度茜素紅溶液中的耳石均可見明顯的標志顏色（圖2）。24h 時，50mg/L 濃度組中耳石標記顏色明顯（圖3），當濃度達到100 mg/L 和150mg/L 時，耳石標志顏色非常強烈（圖4、圖5）。當染料濃度達到200 mg/L 和250mg/L，鳙仔魚全部死亡。

在24h 時，試驗組中鳙幼魚分別暫養(yǎng)1d 和7d后提取耳石觀測（圖3～圖5），發(fā)現(xiàn)暫養(yǎng)7d 鳙耳石染色邊緣已沉積了新的透明狀生長輪，說明耳石隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加而增長。

2.3 鳙飼養(yǎng)周數(shù)與耳石生長的關(guān)系

在13 周連續(xù)提取飼養(yǎng)鳙的耳石中，發(fā)現(xiàn)耳石上的熒光物質(zhì)在光學顯微鏡下依然清晰。耳石長度（L）和相應(yīng)的飼養(yǎng)周數(shù)（W）呈直線相關(guān)式：L=23.869W+16.555（R2=0.9554，n=37），二者存在一一對應(yīng)關(guān)系。

3 討論

3.1 鳙最佳熒光染料

漁業(yè)浸泡標記常用的熒光染料有鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素絡(luò)合物和茜素紅S 等。鹽酸四環(huán)素是一種化學染料和處方藥，具有一定毒性。歐陽斌和常劍波[17]用它標記稀有鯽Gobiocypris rarus，致死率極高，各浸泡濃度組均全部死亡。付自東等[18]利用鹽酸四環(huán)素浸泡胭脂魚Myxocyprinus asiaticus仔、稚魚的耳石，標記效果很差；當濃度150mg/L時，有較高的致死作用。

許莉佳[19]利用鈣黃綠素標記斑馬魚Danio rerio稚魚耳石，表明鈣黃綠素的綠色熒光與稚魚耳石的自發(fā)熒光顏色相近，不容易區(qū)分，標記不顯著，標記率低。李敏達等[20]用鈣黃綠素標記翹嘴紅鲌Culter alburnus 稚魚效果較差。劉巖等[21]利用鈣黃綠素浸泡黑鯛Acanthopagrus schlegelii 不能形成類似的肉眼可見標記痕跡，僅在熒光顯微鏡下可見。

茜素紅S 在翹嘴鲌[20]、黑鯛[21]和中華倒刺鲃[26]中標記效果理想。茜素紅S 毒性低，本文濃度達150mg/L 時，鳙稚魚全部成活；染色的鳙耳石不需熒光顯微鏡，在普通光學顯微鏡下就能檢出，且效果強烈。

綜上所述，四種常用熒光染料中，鹽酸四環(huán)素具有一定毒性，標記物的成活率低；鈣黃綠素與魚類的自發(fā)熒光顏色相近；茜素絡(luò)合物標記物在可見光下達不到強烈效果。茜素紅S 價格低廉，毒性低，低濃度對鳙無損害，在普通光學顯微鏡下就能檢測到強烈標記，為大規(guī)模增殖放流提供了一種簡捷、實用、有效的標記方法。

3.2 最適染色條件

不同魚類對化學染料的耐受性和敏感性不同，因此，最適染色條件也不同[27]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在一定濃度條件下，延長浸泡時間，對魚類沒有顯著的致死，8h 染色能見明顯的標記環(huán)，24h 具有極強的染色效果。24h 染色時常優(yōu)于8h，在100mg/L 濃度內(nèi)，濃度越高，染色越深，高于150mg/L，耳石染色未見明顯的加深，當濃度達到200mg/L，鳙致死。因此，在鳙放流中，100mg/L、24h 為最佳的浸泡染色條件。

3.3 茜素紅S 在增殖放流中的應(yīng)用

在增殖放流效果評估中，標記持續(xù)時間較短是熒光染料的主要缺點，目前對熒光標記的研究主要集中在即時染色效果，對染色結(jié)果長周期追蹤較少。宋昭彬等[16]觀察發(fā)現(xiàn)，第15 日還可觀測到標記環(huán)；趙亞鵬等[10]利用茜素紅及茜素絡(luò)合物標志滇池金線鲃，記錄的持續(xù)時間分別為27 日和26 日。邱晨等[28]利用茜素絡(luò)合物標記鯉Cyprinus carpio 仔魚，浸泡50d 后還可見標記環(huán)。本文每周鏡檢染色鳙耳石，長達90d（13 周）（圖6），在普通光學顯微鏡下還可清晰看見標記色，說明ARS 標記所形成的標記環(huán)在耳石上可長期保存，延長了在增殖放流中跟蹤監(jiān)測的時間。

隨著個體的生長發(fā)育，耳石不斷增長，自無須鱈Merluccius bilincanis[29]被證實存在生長輪以來，鳡Elopichthys bambusa[16]、黃線狹鱈Theragra chalcogramma[30]、大麻哈魚Oncorhynchus keta[31]、月鱧Channa asiatica[32]等魚類耳石陸續(xù)被確證。本研究表明，鳙稚魚的生長與耳石的長度呈顯著的線性關(guān)系（圖6）。據(jù)此，測量回捕標志魚的耳石長度，可以準確推算放流時間和批次，為研究放流魚早期生活史階段生態(tài)習性提供了便利，為增殖放流中有效使用標記技術(shù)提供了理論和技術(shù)支持。