一測多評法測定白芍中3種芍藥苷類成分的含量

張洪坤 郭長達(dá) 楊美華 路麗 高貫彪 吳韶輝

摘要[目的]建立測定白芍中3種芍藥苷類成分含量的一測多評法。[方法]采用HPLC法，以芍藥苷為對照品，同時測定芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的相對校正因子，建立一測多評的方法，并用該方法測定不同產(chǎn)地白芍中3種芍藥苷類成分的含量。[結(jié)果]一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果無明顯差異，RSD均小于5.00%，各相對校正因子準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性良好。[結(jié)論]一測多評法的適用性和可行性在白芍3種芍藥苷類成分的含量測定中得到較好的驗證，可用于白芍的定量分析及質(zhì)量評價。

關(guān)鍵詞白芍;芍藥苷;一測多評法;相對校正因子;含量

中圖分類號R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼A?文章編號0517-6611（2020）15-0211-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.060

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Simultaneous Determination of Three Paeoniflorins in Radix Paeoniae alba by QAMS Method

ZHANG Hongkun1， GUO Changda1， YANG Meihua2 et al

（1. Bozhou Huqiao Pharmaceutical Co.， Ltd.， Bozhou， Anhui 236800;2. Institute of Medicinal Plant Development， Peking Union Medical College， Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100193）

Abstract[Objective] To establish a method of quantitative analysis of multicomponents by singlemarker（QAMS） for determination of three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba. [Method]Using paeoniflorin as the contrast， the relative correction factors（RCF） of albiflorin and benzoyl paeoniflorin were determined by HPLC.And using the QAMS to determine the three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba.from different areas. [Result] There was no obvious difference between the results of the QAMS method and the external standard method，RSD were all less than 5.00%， and the accuracy and reproducibility of each relative correction factor were good.[Conclusion]The QAMS is verified in the determination of three paeoniflorins in Radix Paeoniae alba.It can used for quantitative analysis and quality evaluation of Radix Paeoniae alba.

Key wordsRadix Paeoniae alba;Paeoniflorin;Quantitative analysis of multicomponents by singlemarker（QAMS）;Relative correction factor;Content

基金項目安徽省科技重大專項（18030801119）;國家中醫(yī)藥管理局中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目（ZYBZH-Y-AH-03）。

作者簡介張洪坤（1986—），男，安徽阜陽人，副主任中藥師，碩士，從事中藥研發(fā)及其質(zhì)量評價研究。

收稿日期2020-02-11

白芍首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛茛科多年生草本植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，已有2 000多年的藥用歷史，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽之效[1]，臨床應(yīng)用廣泛。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）為白芍中提取的有效成分，主要含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等單萜苷類化合物，其中以芍藥苷最為典型，含量占芍藥總苷中總苷量的90%以上[2]。白芍總苷的藥理及臨床研究發(fā)現(xiàn)，白芍總苷具有止痛、抗炎、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用，對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病有確切的療效[3]。

2015年版《中國藥典》僅以芍藥苷為其含量的檢測指標(biāo)，盡管芍藥苷含量較高，但仍難以真正體現(xiàn)和保障白芍的內(nèi)在質(zhì)量，傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀要求對中藥材進(jìn)行多藥效成分指標(biāo)的綜合評價，但長期以來一直面臨對照品難得、貨源緊缺和檢測成本昂貴的問題，限制了同時對白芍中3種芍藥苷類成分進(jìn)行含量測定在實際工作中的應(yīng)用。

一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by singlemarker，QAMS）是一種用于多成分含量控制的研究思路，已在木通[4]、人參[5]、黃連、丹參等藥材中得到驗證。周光姣等[6]建立一測多評法測定白芍中沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷5種成分含量，由于指標(biāo)成分太多在實際應(yīng)用中較難實現(xiàn)質(zhì)量監(jiān)測，對此，筆者僅選擇白芍中3種芍藥苷類成分建立一測多評方法，以期實現(xiàn)白芍芍藥苷類成分的質(zhì)量控制，即應(yīng)用供應(yīng)量大、價格較低的芍藥苷對照品作為內(nèi)標(biāo)物，通過建立其與芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的相對校正因子（the relative correction factor，RCF）、相對保留時間（the relative retention time，RRT），計算其成分的含量，實現(xiàn)多指標(biāo)的質(zhì)量控制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent 1200系列高效液相色譜系統(tǒng)，Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×46 mm），色譜柱Waters XBridgeC18（5 μm，250 mm×4.6 mm），色譜柱Thermo AcclaimTM 120-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），XS204型電子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo），MX5型電子天平（d=0.001 mg，Mettler Toledo），RHP-100型高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司），DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市一恒科學(xué)儀器有限公司），KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗儀（40 kHz&500 W，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2試藥。芍藥苷（110736-201539，中國食品藥品檢定研究院，純度96.4%）;芍藥內(nèi)酯苷（成都曼思特生物科技有限公司）;苯甲酰芍藥苷（MUST-16061803，成都曼斯特有限公司，純度99.28%）;乙腈（色譜純，Merck）;磷酸（HPLC級，阿拉丁）;水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.1.3樣品。白芍藥材于2017年先后自安徽、山東、山西、湖南、河南、四川、浙江等白芍主產(chǎn)區(qū)收集，經(jīng)鑒定為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根。樣品來源信息見表1。

1.2方法

1.2.1色譜條件。色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）;流動相為乙腈（A）和0.015%磷酸（B），按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長230 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2對照品混合儲備液的制備。分別取芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，配制成含芍藥內(nèi)酯苷0.16 mg/mL、芍藥苷0.25 mg/mL、苯甲酰芍藥苷0.015 mg/mL的混合對照品儲備液，即得。

1.2.3芍藥苷對照品溶液的制備。取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成0.06 mg/mL的單標(biāo)溶液，即得。

1.2.4供試品溶液的制備。取白芍中粉約0.1 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇35 mL，超聲處理（功率240 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.5方法學(xué)考察。

1.2.5.1線性范圍。取“1.2.2”的混合對照品儲備液，準(zhǔn)確稀釋1、2、4、5、10、20倍，配制成系列的混合對照品溶液，每個濃度分別進(jìn)樣5 μL，以各對照品的峰面積（Y）為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

1.2.5.2精密度試驗。精密吸取同一混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積RSD。

1.2.5.3穩(wěn)定性試驗。取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8、12、24 h時進(jìn)樣分析，測定各待測物峰面積，計算含量RSD。

1.2.5.4重復(fù)性試驗。取同一批白芍粉末，按“1.2.4”方法制備供試品溶液6份，測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷含量的RSD。

1.2.5.5加樣回收率試驗。精密稱取適量已知含量的白芍中粉6份，分別加入一定量的對照品，按“1.2.4”方法制備樣品，測定含量，計算加樣回收率。

1.2.6相對校正因子和相對保留時間計算。取“1.2.2”項下配制的系列濃度的混合對照品溶液，每個濃度分別進(jìn)樣5 μL。以芍藥苷為內(nèi)標(biāo)，按公式fsi=fsfi=As/CsAi/Ci（As為參照物峰面積，Cs為參照物濃度，Ai為其他組分i峰面積，Ci為其他組分i濃度）和Rtis=tRi/tRs（tRs為參照物保留時間，tRi為其他組分i保留時間），分別計算芍藥苷對芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的相對校正因子和相對保留時間。

1.2.7耐用性考察。

1.2.7.1不同波長的影響。考察228、230、232 nm不同波長對校正因子的相對保留時間的影響，計算不同波長下的校正因子和相對保留時間的RSD。

1.2.7.2不同色譜柱及高效液相色譜系統(tǒng)的影響。考察不同色譜柱、色譜系統(tǒng)對校正因子和相對保留時間的影響，計算不同色譜柱、色譜系統(tǒng)的校正因子和相對保留時間的RSD。

1.2.7.3不同流動相pH的影響。考察3個不同流動相pH體系（0.01%磷酸溶液、0.015%磷酸溶液、0.02%磷酸溶液）對相對校正因子和相對保留時間的影響，計算不同流動相pH體系的校正因子和相對保留時間的RSD。

1.2.7.4不同柱溫的影響。考察不同柱溫（25、30、35 ℃）對校正因子和相對保留時間的影響，計算不同柱溫條件下的校正因子和相對保留時間的RSD。

1.2.7.5不同流速的影響。考察不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對校正因子和相對保留時間的影響，計算不同流速條件下的校正因子和相對保留時間的RSD。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1對照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同出峰時間中均有相應(yīng)的峰出現(xiàn)，且該條件下樣品中的目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度較大，空白無干擾，說明此條件適合測定芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的含量。

2.1.2線性范圍。以各對照品的進(jìn)樣量對峰面積進(jìn)行回歸處理，得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷的回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果表明（表3），各對照品的進(jìn)樣量與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3精密度試驗。按照“1.2.5.2”方法操作，結(jié)果顯示，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的峰面積RSD分別為05%、0.9%、0.8%，RSD均小于2.0%，說明儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗。按照“1.2.5.3”方法操作，結(jié)果顯示，0～24 h芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的含量RSD分別為1.3%、0.9%、2.7%，RSD均小于3.0%，說明處理后的樣品溶液中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗。按照“1.2.5.4”方法操作，測得芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷的平均含量分別為0.678%、3170%、0.085%，RSD分別為1.10%、0.90%、2.80%，RSD均小于3.00%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率試驗。按照“1.2.5.5”方法操作，結(jié)果顯示，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的加樣回收率分別為95.9%、98.5%、103.3%，RSD分別為1.60%、1.60%、1.30%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.2相對校正因子和相對保留時間計算分別計算芍藥苷對芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的相對校正因子和相對保留時間，取平均值，結(jié)果表明（表4），以芍藥苷為參照物，芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷的響應(yīng)因子分別為1.072 7和0654 1，相對保留時間分別為0.899 0和2.147 2，RSD均小于2.00%。

2.3耐用性考察

2.3.1不同波長的影響。從不同波長對校正因子和相對保留時間的影響（表5）可以看出，波長變化對校正因子和相對保留時間無明顯影響，通常控制波長為230 nm即可。

2.3.2不同色譜柱及高效液相色譜系統(tǒng)的影響。從不同色譜柱、色譜系統(tǒng)對校正因子和相對保留時間的考察結(jié)果（表6）可以看出，各成分校正因子的RSD在1.20%～2.30%，相對保留時間的RSD在0.80%～3.50%，表明該方法耐用性良好。

2.3.3不同流動相pH的影響。不同流動相pH體系（001%磷酸溶液、0.015%磷酸溶液、0.02%磷酸溶液）對相對校正因子和相對保留時間的影響（表7），流動相pH對各成分的校正因子、相對保留時間影響較小，耐用性良好。

2.3.4不同柱溫的影響。從不同柱溫（25、30、35 ℃）對校正因子和相對保留時間的影響（表8）可以看出，柱溫對各成分的校正因子、相對保留時間影響較小，通常情況下可以選擇30 ℃進(jìn)行試驗。

2.3.5不同流速的影響。從不同的流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對校正因子和相對保留時間的影響（表9）可以看出，流速對各成分的校正因子、相對保留時間影響較小，耐用性良好。

2.4含量的測定

分別采用一測多評法和外標(biāo)法計算白芍樣品中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量，結(jié)果見表10。常規(guī)的外標(biāo)法實測含量與一測多評計算的含量值經(jīng)t檢驗比較，P>0.05，表明一測多評法與外標(biāo)法所測定的芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量無明顯差異，RSD<5%，表明一測多評法可以用來測定白芍中3種芍藥苷類成分的含量。

3討論

在參考《中國藥典》[7]、查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[8-10]，該試驗分別考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇等不同提取溶劑，超聲、回流等不同提取方法，發(fā)現(xiàn)藥典的提取方法能夠兼顧芍藥苷類成分，得到滿意的提取率，雜質(zhì)干擾峰較少，且方法簡單，故該研究將其作為此次試驗的提取條件。

該研究采用HPLC法，以芍藥苷為對照品，用外標(biāo)法測定了其在白芍藥材中的含量，計算芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的相對校正因子，然后用獲得的相對校正因子計算芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量，實現(xiàn)一測多評。再用外標(biāo)法測定了白芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量，比較了其與采用相對校正因子計算值之間的差異，結(jié)果表明各成分采用相對校正因子計算的含量值與外標(biāo)法測定值之間無顯著性差異。一測多評法的適用性和可行性在白芍3種芍藥苷類成分含量測定中得到了驗證。該法在兼顧藥典指標(biāo)的同時還能兼顧其他成分的質(zhì)量控制，在不增加成本的同時實現(xiàn)了白芍質(zhì)量控制的提升，可用于白芍的定量分析及質(zhì)量評價。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉曉龍，劉大培，尚志鈞.白芍、赤芍的本草考證[J].中國藥學(xué)雜志，1993，28（10）：626-628.

[2] 高小榮，田庚元.白芍化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志，2006，15（16）：416-418.

[3] 韓珍，賀弋.白芍總苷的藥理作用及其毒性研究進(jìn)展[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，30（4）：538-541.

[4] 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測多評”法中藥質(zhì)量評價模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

[5] 朱晶晶，王智民，匡艷輝，等.一測多評法同步測定人參和三七藥材中多種人參皂苷的含量[J].藥學(xué)學(xué)報，2008，43（12）：1211-1216.

[6] 周光姣，白華，權(quán)春梅，等.一測多評法測定白芍中的五種成分含量[J].皖西學(xué)院學(xué)報，2018，34（5）：85-88.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：105.

[8] 劉文斌，何振輝，賓漫容.中藥白芍的HPLC含量測定及指紋圖譜研究[J].光譜實驗室，2010，27（2）：693-699.

[9] 李越峰，任彥冬，楊武亮.等.不同產(chǎn)地白芍芍藥苷含量的測定和比較研究[J].長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，21（4）：28-29.

[10] 張瑜，唐志書，張崗，等.白芍中芍藥苷提取方法的比較研究[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥，2013，33（1）：84-86，93.