LPS誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥損傷模型的建立

摘要采用LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型，通過(guò)研究細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)驗(yàn)證模型，為進(jìn)一步對(duì)子宮內(nèi)膜炎發(fā)病機(jī)理的研究和治療藥物療效的評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。經(jīng)組織塊原代培養(yǎng)和胰酶純化分離得到奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，并通過(guò)免疫組化鑒定細(xì)胞純度。采用0、10、30、50、100 μg/mL 的LPS分別在3、6、9、12、18 h刺激純化后的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，采用MTT法篩選出最佳刺激濃度時(shí)間為30 μg/mL，12 h，然后以最佳刺激濃度刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，在12 h后收集細(xì)胞，最后通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)差異性。

關(guān)鍵詞奶牛子宮內(nèi)膜炎;子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞;細(xì)胞因子

中圖分類(lèi)號(hào)S858.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2020）15-0105-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment of Inflammatory Injury Model of Endometrial Epithelial Cells Induced by LPS in Cows

CHEN Jiajia

（Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442）

Abstract The model of endometrial epithelial cell inflammation induced by LPS was used to study the expression of IL1β，TNFα mRNA，and lay the foundation for further pathogenesis of meningitis in utero treatment of research and evaluation of drug efficacy.Bovine endometrial epithelial cells （BEEC） were obtained and purified from cow uterus with primary cultured tissue explant and trypsin，and identified by immunohist chemistry.We used 0，10，30，50，100 μg/mL concentrations of LPS，respectively，after 3，6，9，12 h to stimulate purified endometrial epithelial cells，the results showed that the best situmulation concentration and time screened out by MTT method were 30 μg/mL（LPS） and 12 h respectively.BEEC were stimulated with 30 μg/mL LPS 12 h，and the cells were collected and ?fluorescence quantitative RT-PCR was made in order to detect the mRNA expression differences of IL1β，TNFα.

Key wordsCow endometritis;Endometrial epithelial cells（BEEC）;Cytokines

作者簡(jiǎn)介陳佳佳（1989—），女，河南洛陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事畜牧獸醫(yī)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究。

收稿日期2019-12-03;修回日期2019-12-20

子宮是胚胎附植和孕育胎兒的場(chǎng)所。子宮壁由內(nèi)膜、肌層和漿膜層構(gòu)成。子宮內(nèi)膜是激素作用的靶組織，在生殖生理研究中占據(jù)重要地位。哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜由上皮和固有層構(gòu)成。正常情況下，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞受卵巢激素的調(diào)節(jié)發(fā)生周期性變化。奶牛分娩會(huì)對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械性損傷[1]，然而子宮復(fù)舊尚未完全，病原菌的污染會(huì)導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜炎。病原微生物可引起子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生一系列的病理解剖學(xué)變化，包括核染色質(zhì)凝聚趨邊、核膜斷裂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體腫脹變形[2]。在急性卡他性和化膿性子宮內(nèi)膜炎中，患牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的變性、壞死[3]。王洪海等[4]報(bào)道，對(duì)產(chǎn)后6～10 d的健康牛和急性子宮內(nèi)膜患牛子宮內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎患牛相當(dāng)對(duì)照組子宮內(nèi)膜局部嚴(yán)重脫落，上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞大量破損[4]。

在奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌中，大腸桿菌等革蘭氏陰性菌占有很大比例。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，由類(lèi)脂A、非特異性核心多糖和O抗原3部分組成，其中類(lèi)脂A是“毒力中心”[5]。當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或人工破壞菌細(xì)胞后釋放，又稱(chēng)內(nèi)毒素。脂多糖作為介導(dǎo)革蘭陰性菌膿毒癥的重要啟動(dòng)因子，通過(guò)與其受體及其調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合，從而誘導(dǎo)機(jī)體多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)的合成和釋放，觸發(fā)機(jī)體一系列病理生理過(guò)程[6]。筆者采用MTT法檢測(cè)LPS對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）細(xì)胞的增殖變化，建立奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性損傷模型，并通過(guò)檢測(cè)IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平驗(yàn)證模型，旨在為進(jìn)一步探討LPS誘導(dǎo)BEEC細(xì)胞炎性損傷機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞來(lái)源。奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，原代組織培養(yǎng)第3～4代。

1.1.2儀器。

倒置生物顯微鏡（日本OLYMPUS，IX71/IX2）;二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO，MCO-18AIC）;酶標(biāo)儀（美國(guó)BIORAD，680 型）;核酸濃度測(cè)定儀（德國(guó)Eppendorf公司）;熒光定量PCR儀（美國(guó)STRATAGENE，MX3005P）。

1.1.3試劑。 胎牛血清（美國(guó)GIBCO，批號(hào)8199549）;DMEM/F12+GlutaMAX培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO，批號(hào)1354752）;O55∶B5脂多糖（Sigma 公司，L2880）牛角蛋白免疫組化試劑盒（上海研卉生物公司）;DAB Kit（北京中杉金橋生物公司）;M- mLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq?DNA聚合酶、RNA 酶抑制劑、dNTP（Promega 公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分離純化。

1.2.1.1試驗(yàn)動(dòng)物取樣。

從屠宰場(chǎng)選取臨床正常，產(chǎn)后復(fù)舊完全的荷斯坦奶牛的子宮，30 min內(nèi)結(jié)扎分離2個(gè)子宮角。用無(wú)菌生理鹽水（添加400 IU/mL青霉素，鏈霉素）保存，置于冰盒，1 h內(nèi)送入實(shí)驗(yàn)室。

1.2.1.2奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)：組織塊培養(yǎng)法。

在超凈工作臺(tái)上，用剪刀剪開(kāi)子宮角中段的側(cè)壁，暴露子宮腔;隨后將子宮內(nèi)膜小心從子宮肌層上剝離下來(lái)，注意將肌層組織剝離干凈，并放入平皿中。用添加雙抗的PBS反復(fù)沖洗組織塊，直至沖洗液變清亮為止。用彎頭手術(shù)剪反復(fù)剪切子宮內(nèi)膜至1 mm 3小塊為止，離心棄去上清，加入新的培養(yǎng)液，吸取若干組織塊，放入培養(yǎng)瓶中;小塊相互距離以0.5 cm為宜。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置于CO?2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 h后;向培養(yǎng)瓶中注入少量細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/F12GlutaMAX+10%FBS+雙抗），慢慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后補(bǔ)加少量細(xì)胞培養(yǎng)液。每天顯微鏡下觀察細(xì)胞游出情況，每隔1天換液1次。

1.2.1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定。

胰酶消化貼壁細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取0.1 mL 10倍稀釋。將稀釋后的細(xì)胞懸液與0.3%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9∶1混合均勻，滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在3 min內(nèi)，低倍鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)器分別記錄活細(xì)胞（無(wú)色透明）和死細(xì)胞（藍(lán)色）數(shù)量，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力：

細(xì)胞濃度=（4個(gè)大方格內(nèi)活細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)（1）

活細(xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/（活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)）×100%（2）

1.2.1.4奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離純化。

當(dāng)組織培養(yǎng)8～9 d后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞呈單層鋪開(kāi)，用槍頭小心地將組織塊吹下并從培養(yǎng)瓶里棄去，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS洗滌細(xì)胞2次，向25 mL細(xì)胞瓶里加入37 ℃預(yù)熱的0.25%的胰蛋白酶溶液0.5 mL，水平晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶消化3～5 min，在倒置顯微鏡下觀察到大多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞變圓脫壁時(shí)，用PBS漂洗以除去基質(zhì)細(xì)胞，隨后加入1 mL的0.25%的胰酶-EDTA消化2～3 min，用細(xì)胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)，輕輕吹打細(xì)胞瓶?jī)?nèi)壁，15 mL離心管收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min下離心5 min，棄上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力計(jì)算后，按細(xì)胞濃度105個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO?2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的鑒定。

角蛋白是上皮細(xì)胞膜上的特異性蛋白，通過(guò)免疫組化法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞膜上角蛋白的表達(dá)，從而判斷細(xì)胞純化程度。經(jīng)分離純化后，得到純度較高的上皮細(xì)胞，當(dāng)融合率達(dá)到90%以上，用0.25%的胰酶-EDTA消化，傳代在6孔板中，孔板中放置高壓處理好的蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)匯合后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次。4%的多聚甲醛固定15～30 min;空氣干燥5 min，用眼科鑷小心取出蓋玻片，注意玻片正反面。PBS洗滌2次。0.5%Triton X-100（DPBS配）孵育1次20 ?min。PBS清洗標(biāo)本3次各2 ?min。加入3%H?2O?2浸泡10 min，除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，PBS沖洗3次;加入3% H?2O?2浸泡10 min，除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，PBS沖洗3次;將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐中蒸煮3 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS沖洗3次;加入1滴山羊血清進(jìn)行抗原修復(fù)，37 ℃孵育15 min;加入1滴1∶100倍稀釋的一抗，37 ℃孵育45 min，PBS沖洗5次;加入1滴生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗），37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5次;DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）;蘇木精復(fù)染10 min，沖洗;封片，拍照。

1.2.3 MTT篩選LPS作用濃度時(shí)間。

胰酶-EDTA消化并收集BEEC，臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105 cell/mL，加入200 μL/well細(xì)胞懸液于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO?2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞80%匯合后，吸取上清，PBS洗2遍后，分別加入0、10、30、50、100 μg/mL的LPS（用不含血清的無(wú)色培養(yǎng)基配置），分別在培養(yǎng)3、6、9、12、18 h后每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL，PBS溶解，用孔徑0.22 mm濾膜過(guò)濾），4 h后棄掉培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振蕩混勻，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD）。

細(xì)胞存活率=LPS組的OD值/對(duì)照組OD值×100%（3）

1.2.4RT-PCR檢測(cè)LPS對(duì)BEEC細(xì)胞因子基因水平表達(dá)的影響。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)傳代3次以上，當(dāng)IEC-6細(xì)胞融合率在95%以上時(shí)，用0.25%的胰酶-EDTA消化后加含15%的血清的DMEM/F12GlutaMAX完全培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)1 d后，處理前用無(wú)鈣鎂PBS洗2次。

BEEC細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組且設(shè)定3、6、9、12 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。對(duì)照組，用DMEM/F12GlutaMAX培養(yǎng);模型組，先用DMEM/F12GlutaMAX培養(yǎng)2 h后，用DMEM/F12GlutaMAX配制的30 μg/mL的LPS培養(yǎng)3、6、9、12 h。選取3～5代純化后的BEEC，傳代于六孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按試驗(yàn)分組的要求處理細(xì)胞。細(xì)胞處理完成后，棄去培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS洗滌2次，加入1 ?mL 預(yù)冷的Trizol，充分吹打使裂解完全，室溫放置反應(yīng)5～10 min。提取RNA，加入0.1 % DEPC水20～30 μL，用槍頭緩慢吹吸或離心，使RNA溶解混勻，-80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｎ? μL使用核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，使用RNA反轉(zhuǎn)錄兩步法合成cDNA。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的牛待測(cè)基因序列，使用Primer premier 5.0和Oligo6.0軟件在其相對(duì)保守區(qū)域設(shè)計(jì)基因的特異性上下游引物，并由上海生工生物工程公司合成。引物序列見(jiàn)表1。引物開(kāi)蓋前應(yīng)先離心，慢慢打開(kāi)，以防干粉狀引物散失，按照說(shuō)明書(shū)要求加適量滅菌處理過(guò)的DEPC水溶解，關(guān)閉管蓋，充分振蕩5～10 min，配成100 μmol/L的貯存液，分裝后-20 ℃下保存。

RT-PCR反應(yīng)體系如下：1.000 μL cDNA，1.000 μL上游引物，1.000 μL下游引物，12.500 μL Brilliant SYBR Green QPCR master Mix，0.375 μL ROX，9.125 μL DEPC水。

RT-PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 ?min;95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件如下：95 ℃ 1 min;55 ℃ 30 s;95 ℃ 30 s。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次獨(dú)立的Real-time PCR全過(guò)程。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.1組織塊法培養(yǎng)的BEEC和BESC

組織培養(yǎng)后一般在第4天左右開(kāi)始出現(xiàn)組織塊邊緣變圓，基質(zhì)細(xì)胞呈梭形從組織塊周?chē)绯觯纬伞凹?xì)胞暈”，在第7天呈鋪石狀的上皮細(xì)胞游出，如圖1A所示;隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BESC分裂增殖，細(xì)胞連接成束，平行排列;BEEC呈多邊形，以團(tuán)塊形式生長(zhǎng)，細(xì)胞連接緊密，BESC可抑制BEEC延伸生長(zhǎng);如圖1B所示，箭頭所指為2種細(xì)胞生長(zhǎng)的交界處;當(dāng)細(xì)胞暈圈寬度是組織塊的半徑的1～2 倍，適合分離純化和傳代。圖1C為純化后的奶牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。圖1D為純化后的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

2.2免疫組化鑒定BEEC

純化分離后的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)免疫組化法檢測(cè)角蛋白的表達(dá)，如圖2所示，上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅棕色，角蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性，初步估算上皮細(xì)胞純度達(dá)95%。

2.3MTT篩選LPS作用濃度和刺激時(shí)間

如圖3所示，30 μg/mLLPS作用12 h后，BEEC活力顯著下降（P<0.05）;50 μg/mL LPS作用12、18 h后，BEEC活力極顯著下降（P<0.01）;100 μg/mL LPS作用9 h后，細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05），作用12、18 h可以極顯著抑制BEEC活力（P<0.01）。

篩選結(jié)果表明，30 μg/mL的LPS作用12 h后BEEC活力顯著下降（P<0.05），并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，30 μg/mL及其以上的濃度刺激細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞活力極顯著下降（P<0.01），故當(dāng)LPS濃度為30 μg/mL作用BEEC 12 h時(shí)細(xì)胞活力形成明顯拐點(diǎn)，3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，選定該條件作為最佳作用時(shí)間濃度。

2.4RT-PCR檢測(cè) LPS對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞因子IL-1β mRNA表達(dá)的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，30 μg/mLLPS作用子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞3、6、9、12 h IL-1β的表達(dá)量均極顯著上升（P<0.01）。

2.5RT-PCR檢測(cè)LPS對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，30 μg/mLLPS作用子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞3、6、9、12 h TNF-α 的表達(dá)量極顯著上升（P<0.01）。

3討論

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)之一。奶牛子宮內(nèi)膜是機(jī)體抵抗侵入物的第一道防線，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在阻止子宮免受感染中扮演重要的角色。因此，奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞被廣泛用于奶牛子宮生殖生理或病理以及分子基因和蛋白水平發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。為了保證細(xì)胞性狀的穩(wěn)定性，避免細(xì)胞因多次傳代而老化，故選用體外原代培養(yǎng)3～4代純度較高的奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（bovine endometrial epithelial cells，BEEC）用于體外研究的細(xì)胞模型。通過(guò)LPS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同濃度和時(shí)間的刺激，探討LPS對(duì)BEEC細(xì)胞增殖能力、形態(tài)學(xué)損傷的影響，以此作為建立并評(píng)價(jià)BEEC細(xì)胞體外炎性損傷模型，進(jìn)一步用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

MTT法作為檢測(cè)細(xì)胞增殖的經(jīng)典方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，且操作快速、簡(jiǎn)便[7-9]。該研究中采用不含血清的無(wú)色培養(yǎng)基配置LPS，從而既避免了血清對(duì)LPS的干擾，也避免了一般培養(yǎng)液中酚紅成分對(duì)吸光度的干擾。查閱相關(guān)文獻(xiàn)后，經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)篩選后，選取0～100 μg/mL的濃度和0～24 h作用時(shí)間的范圍內(nèi)繼續(xù)篩選模型條件。結(jié)果表明，在6 h內(nèi)，LPS作用劑量100 μg/mL內(nèi)，對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖不會(huì)產(chǎn)生明顯的抑制作用，9 h時(shí)100 μg/mLLPS對(duì) BEEC活力顯著下降（P<0.05），12 h時(shí)30 μg/mLLPS可以顯著抑制BEEC活力（P<0.05），30 μg/mL以上濃度的LPS刺激時(shí)間達(dá)12 h以上可以極顯著抑制細(xì)胞活力（P<0.01），結(jié)合LPS在體內(nèi)所能達(dá)到最高濃度的考慮，故選取30 μg/mL、12 h作為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)BEEC炎性損傷模型條件。這與之前報(bào)道的小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外炎癥模型所用的LPS濃度為100 ng/mL差異較大，可見(jiàn)該炎癥模型中細(xì)胞不同，LPS 作用濃度和時(shí)間差距較大[10]。在一定程度上驗(yàn)證了張桂林等關(guān)于10～100 μg/mL的LPS對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮

細(xì)胞有不同程度的抑制作用且LPS作用呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性的報(bào)道[11]。倒置顯微鏡下觀察BEEC形態(tài)學(xué)變化，30 μg/mL的LPS作用BEEC 12 h，細(xì)胞一定程度的損傷，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比模型組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化明顯，細(xì)胞隆起，部分細(xì)胞皺縮脫落。

LPS經(jīng)脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）/CD14的識(shí)別與調(diào)控后，形成LPS-LBP復(fù)合物，與細(xì)胞表面的CD14/TLRs受體結(jié)合，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)將信號(hào)到細(xì)胞核，激活NF-κB，進(jìn)而調(diào)控炎癥網(wǎng)絡(luò)分子的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。NF-κB活化后可以誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄，使其產(chǎn)生和分泌增多，其正反饋效應(yīng)可進(jìn)一步激活NF-κB，進(jìn)而調(diào)控IL-6、IL-8的產(chǎn)生和釋放[12]。NF-κB活化的同時(shí)，使IκBα、P105等抑制基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。IL-1β可激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2（COX-2）和發(fā)熱反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成組織損傷[13]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）因最初發(fā)現(xiàn)其能使腫瘤組織細(xì)胞發(fā)生出血性壞死而得名，包括TNF-α和TNF-β兩類(lèi)。TNF-α主要是由活化的單核-巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，可激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等功能，導(dǎo)致IL-1，IL-6等炎性介質(zhì)的分泌，促進(jìn)組織炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[14]。利用30 μg/mLLPS刺激后RT-PCR檢測(cè)IL-1β mRNA表達(dá)水平顯著上升，TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著下降，說(shuō)明LPS能啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起IL-1β、TNF-α 等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的合成釋放，從而導(dǎo)致奶牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞的損傷。因此，LPS濃度30 μg/mL，刺激時(shí)間12 h作為奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外炎癥損傷模型建立條件。

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