微生態制劑對凡納濱對蝦生長·酶活及養殖水質的影響

劉憶瀚 藺凌云 尹文林 潘曉藝 姚嘉赟 徐洋 沈錦玉

摘要為了研究3種微生態制劑不同的組合方案對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長性能、酶活力和抗氧化能力的影響，根據正交試驗設計，在飼料中添加不同比例的微生態制劑，確定3因素添加量的最優組合：LK（干酪乳桿菌）107 CFU/mL、NJ（側孢芽孢桿菌）106 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢桿菌）107 CFU/mL。通過向養殖水體定期潑灑不同組合方案的微生態制劑，確定了3種微生態制劑添加量的最優組合為：LK（干酪乳桿菌）107 CFU/mL、NJ（側孢芽孢桿菌）107 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢桿菌）106 CFU/mL。將最優組合微生態制劑全池定期潑灑與普通對蝦養殖池的水體水質及對蝦養殖情況進行對比，結果表明微生態制劑對養殖水體水質COD平均降解率為8%，氨氮平均降解率24.4%，亞硝酸鹽氮平均降解率31.1%，總氮平均降解率30.1%，總磷平均降解率9.8%，養殖收益較對照組提高了18.7%。

關鍵詞凡納濱對蝦;微生態制劑;生長性能;消化酶活力;抗氧化酶活力;水質凈化

中圖分類號S968.22文獻標識碼A文章編號0517-6611（2020）15-0096-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Probiotics Preparation on the Growth， Enzyme Activities，Aquatic Water of Litopenaeus vannamei

LIU Yihan， LIN Lingyun， YIN Wenlin et al

（Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries， Huzhou，Zhejiang ?313001）

AbstractIn order to study the effects of different combinations of three kinds of probiotics preparation on the growth， enzyme activities and antioxidant capacity of Litopenaeus vannamei， different proportions of three kinds of probiotics preparation were added in the feed according to orthogonal test design. The optimal combination added in the feed was LK （Lactobacillus casei） 107 CFU/mL， NJ （Bacillus laterosporus） 106 CFU/mLand JXCB-2 （Bacillus licheniformis） 107 CFU/mL. Different proportions of three kinds of probiotics preparation were regularly splashed in the culture water body， and the optimal combination added in the culture water was LK 107 CFU/mL， NJ 107 CFU/mL， JXCB-2 106 CFU/mL. In addition， the optimal combination of probiotics was regularly splashed in the culture pond， which was compared with the water quality and shrimp culture in the control pond. The results showed that average COD degradation rate of culture water body was 8%， the ammonia nitrogen decreased by 24.4%， the nitrite nitrogen decreased by 31.1%， the total nitrogen decreased by 30.1%， the total phosphorus decreased by 9.8%， and the economic income of shrimp culture increased by 18.7% compared with control group.

Key wordsLitopenaeus vannamei;Probiotics preparation;Growth performance;Digestive enzyme activity;Antioxidant enzyme activity;Water purification

基金項目“十二五”農村領域國家科技支撐計劃課題（2015BAD13B04）。

作者簡介劉憶瀚（1993—），男，浙江湖州人，研究實習員，從事水產保護學研究。*通信作者，研究員，碩士，碩士生導師，從事水產病害防控研究。

收稿日期2019-10-23;修回日期2019-11-29

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）自1988年引入我國以來，憑借其生長速度快、營養要求低、出肉率較高、抗逆性較強等優點，成為我國養殖面積最廣、養殖產量最高的對蝦種類[1]。近些年，在市場利益的帶動下，高產量高收益的凡納濱對蝦發展迅速，養殖戶的熱情也很高，但由于水質變差以及蝦病害的暴發，導致許多養蝦人損失慘重。雖然目前抗生素等藥品能對對蝦的部分疾病產生作用[2]，但病原也會相應的產生抗藥性[3]，從而導致藥性的降低，并且藥物的殘留會污染養殖水體，打破水體中有益微生物平衡，對對蝦產生二次污染[4]。微生態制劑的使用不僅可以穩定養殖水體，減少病害的暴發[5]，而且可以促進對蝦的生長[6-7]，提高對蝦機體的免疫力并且提高養殖產量和效益。

微生態制劑因其副作用小、無殘留、成本低、效果顯著、不污染環境等特點，使其在凡納濱對蝦養殖中應用越來越受到養殖戶的關注。目前研究較多的是芽孢桿菌、乳酸菌類等。尤其是芽孢桿菌屬（Bacillus）自身可以產生大量的胞外酶，在對蝦中使用可以增加其腸道脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的活力，提高對蝦對飼料的消化率[8]。Ziaei-Nejad等[9]評價了芽孢桿菌屬的幾種常見有益菌對對蝦生長、存活及消化酶活力的影響，表明芽孢桿菌產生的胞外酶類物質能有效將脂類、蛋白質及碳水化合物等有益成分降解成小分子物質。乳酸菌可以分泌多種有益物質，對對蝦本身起到多種功效，如修復對蝦腸道損傷、提高對蝦的非特異免疫機能、改善對蝦飼料的消化吸收等，因此乳酸菌能應用在對蝦的養殖過程中，對對蝦的健康生長起到促進作用，進而可以提高對蝦自身的抗病能力。王國霞等[10]在凡納濱對蝦飼料中添加了液體嗜酸乳桿菌（L.acidophilus），結果表明在對蝦飼料中添加10%的乳酸菌可以在一定程度上提高凡納濱對蝦的生長性能和消化酶活性，改善其非特異性免疫力。乳酸菌在對蝦病害防控上的作用值得肯定，但需要通過后噴涂、拌料、篩選耐高溫菌株等方式解決乳酸菌抗逆性差的問題[11]。

筆者在結合現有資料的基礎上，將干酪乳桿菌、側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌3株土著微生物分別制備成發酵液，并按一定比例拌入對蝦飼料中，探究其對凡納濱對蝦生長性能、酶活力及抗氧化能力的影響;同時，選取微生態制劑為研究對象，將其潑灑入凡納濱對蝦養殖水體中，評估其對水質的凈化效果以及對養殖收益的影響，旨在為微生態制劑在凡納濱對蝦養殖過程中的添加和使用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用蝦：凡納濱對蝦購自紹興市上虞區明誠農業養殖開發有限公司對蝦養殖示范區，體質量（5.0±0.5）g，體質健壯。蝦苗購自正大集團中正苗，體長為（0.60±0.05）cm。投喂的飼料統一購自浙江海大飼料有限公司的對蝦配合飼料，蛋白質含量為43%，不含微生態制劑成分。

微生態制劑：3株土著微生物LK（干酪乳桿菌）、NJ（側孢芽孢桿菌）、JXCB-2（地衣芽孢桿菌）由筆者所在實驗室2017年從凡納濱對蝦養殖池塘中分離純化所得。3種微生物活菌量分別達到5.43×109、7.36×109、5.10×109 CFU/mL。

養殖池塘：選取紹興市上虞區明誠農業養殖開發有限公司養殖示范區2個規格相同的養殖池塘作為監測對象。每個養殖池塘面積0.53 hm2，水深2 m，配套獨立的排污進水系統，水面及水底增氧充足，整體養殖條件較完善。

1.2試驗方法

1.2.1內服微生態制劑的研究。

采用3因素3水平正交試驗設計。根據L?9（34）正交設計表（表1）配制9種試驗顆粒飼料。試驗的顆粒飼料是在對蝦配合飼料中，按終濃度為0、106、107 CFU/mL 3個水平的比例拌入微生物制劑發酵液，充分混勻吸收，在室內晾干制成干顆粒飼料。具體操作方法是將微生態發酵液用噴壺均勻的噴灑在顆粒飼料的表面，晾干后制成干顆粒飼料，基本不會影響顆粒飼料的耐水性，保證飼料投喂過程中不松散。

取規格均勻、體質健壯的810尾對蝦分別放入100 cm×80 cm×65 cm的塑料桶進行試驗，桶內水體體積400 L，共分為9組，每組設置3個重復，每個重復30尾。試驗期間，水溫24～30 ℃，鹽度2.5‰～3.5‰，pH 8.5～9.0，連續充氣。每天投喂3次（06：30、12：30、18：30），投飼量約占蝦體重的5%，持續投喂至試驗結束。試驗持續28 d。在試驗期間，于28 d投飼結束后停食24 h采集肝胰腺、腸道和血液，血液4 ℃下靜置4 h，以4 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃下保存。剔除脂肪組織后的肝胰腺和腸道，用4 ℃的去離子水沖洗，然后用濾紙吸干水分，-20 ℃下保存備用。試驗結束后，測量各組凡納濱對蝦酶活力、抗氧化能力、存活率及增重率。測定時，將保存的肝胰腺和腸道解凍，以1∶9的質量體積比在冰浴下勻漿，2 500 r/min 4 ℃下離心10 min，取上清液-20 ℃下保存，6 h內檢測完成。

1.2.2外用微生態制劑的研究。

1.2.2.1

微生態制劑優化試驗。試驗在紹興市明誠農業有限公司養殖場進行。試驗塑料桶規格為100 cm×80 cm×65 cm，桶內水體體積400 L，放置于養殖場透光塑料大棚下，按表1中分組共分為9個組，每個組3個重復，每個重復30尾。凡納濱對蝦取自公司內養殖池塘，規格為（5.0±0.5）g/尾，每天按對蝦體重的5%投飼，分3次投喂。試驗前分別測量各組水質指標，試驗開始時每隔7 d按表1所列組合在各組中潑灑微生態制劑1次，試驗持續28 d。試驗結束時測量水質指標，得出微生態制劑潑灑時的最優組合。試驗期間保持桶底吸污，持續充氣增氧，不大量換水、少量補水以補充自然蒸發的水量。

1.2.2.2

池塘養殖試驗。試驗按照表2進行，分微生態制劑組及對照組，其中微生態制劑組養殖過程中全池每周一次潑灑最優組合的微生態制劑，對照組按養殖場常規管理水質方法進行操作。

每隔7 d隨機取100 mL養殖池塘的水樣，抽濾后進行氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮、總磷、COD等水質指標的測定。養殖3個月結束時，記錄各組凡納濱對蝦總產量及平均規格計算各組的總產值，并根據成本計算各組的利潤及產出比。

1.3水質的測定

氨氮的含量測定采用納氏試劑法，亞硝酸氮含量測定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法，鹽度使用鹽度計測定，溫度、pH使用美國哈希HACH水質分析儀，型號HQ30d單路輸入多參數數字化分析儀。總氮、總磷、COD使用美國哈希HACH試劑盒及美國哈希HACH分光光度計DR2000測定。

1.4相關酶活性的測定

對各處理組凡納濱對蝦進行蛋白酶（protease）、脂肪酶（lipase）、淀粉酶（amylase）、纖維素酶（cellulase）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、酚氧化酶（phenol oxidase，PO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、堿性磷酸酶（alkaline ?phosphatase，AKP）活力的測定，均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，具體操作過程參照試劑盒說明書進行。

1.5數據統計與分析

數據和圖表使用Excel軟件處理，方差分析及顯著性差異比較采用SPSS 22.0統計軟件處理，P<005表示差異顯著，結果均以平均值±標準誤表示。

安徽農業科學2020年

2結果與分析

2.1內服微生態制劑對凡納濱對蝦生長的影響

2.1.1微生態制劑對凡納濱對蝦生長性能的影響。

由表3可知，試驗開始時，各組應有凡納濱對蝦90尾，平均體質量均控制在（5.0±0.5）g/尾。28 d試驗結束時，對照組存活率75.6%，其余組成活率均顯著高于對照組（P<0.05）。對照組最終平均體質量7.67 g/尾，增重率53.3%，第2、4、6、7、9組增重率顯著高于對照組（P<0.05）。試驗組攝食率和餌料系數均顯著高于對照組（P<0.05）。

2.1.2微生態制劑對凡納濱對蝦消化酶活力的影響。

由表4可知，各組蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶活力差異不顯著（P>0.05）。其中107 CFU/mL LK組蛋白酶和淀粉酶活力最高，極差為12.88和1.61;106 CFU/mL LK組脂肪酶和纖維素酶活力最高，極差為3.21和0.23。106 CFU/mL的NJ組蛋白酶和淀粉酶活力最高，極差為32.5和1.28;107 CFU/mL NJ組脂肪酶和纖維素酶活力最高，極差為5.04和0.27。107 CFU/mLJXCB-2組蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力最高，極差分別為8.82、3.07和1.34 CFU/mL;0 ?CFU/mL JXCB-2組纖維素酶活力最高，極差為0.33。

2.1.3微生態制劑對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響。

由表5可知，各組SOD、PO、POD、AKP活力差異不顯著（P>005）。其中，107 ?CFU/mL LK組SOD、PO、POD、AKP活力最高，極差分別為1.40、0.04、0.04和0.06。107 ??CFU/mL的NJ組SOD和AKP活力最高，極差為0.94和0.01;106 ??CFU/mL NJ組POD活力最高，極差為0.03;0 ??CFU/mL NJ組PO活力最高，極差為0.03。106 ??CFU/mL JXCB-2組SOD活力最高，極差為1.46;各水平JXCB-2組PO、POD、AKP活力無顯著差異，極差為0、0.01和0.02。

綜合3因素不同水平的作用以及考慮到生產成本，認為添加量的最優組合：LK 107 CFU/mL、NJ 106 CFU/mL、JXCB-2 107 CFU/mL。

2.2外用微生態制劑對養殖水體的影響

2.2.1優化微生態制劑組合。

由表6可知，第3、5、6、7、8、9組COD含量顯著低于對照組（P<0.05），第2、4、6、7、9組氨氮含量顯著低于對照組（P<0.05），第4、7、9組亞硝酸鹽氮含

量顯著低于對照組（P<0.05），第2、3、4、6、7、8、9組總氮含量顯著低于對照組（P<0.05），第5、6、7、9組總磷含量顯著低于對照組（P<0.05）。其中，107 CFU/mL的LK組COD、氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮、總磷含量最低，極差分別為11.33、0.09、0003、1.16和0.25。107 CFU/mL的NJ組COD、氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮、總磷含量最低，極差分別為5.67、0.12、0.003、1.30和0.04。107 CFU/mL的JXCB-2組COD含量最低，極差為0.67;106 CFU/mL的JXCB-2組氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮、總磷含量最低，極差為0.18、0.005、1.07和0.07。

綜合3因素不同水平的作用以及考慮到生產成本，認為添加量的最優組合：LK（干酪乳桿菌）107 CFU/mL、NJ（側孢芽孢桿菌）107 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢桿菌）106 CFU/mL。

2.2.2微生態制劑對池塘養殖水體水質的影響。

通過全池每周一次定期潑灑“2.2.1”中最優組合微生態制劑，觀察微生態制劑對池塘養殖水體水質的影響。從圖1～5可知，在養殖期間微生態制劑組各水質指標總體上呈下降趨勢，其中COD平均降解率為8%，氨氮平均降解率24.4%，亞硝酸鹽氮平均降解率31.1%，總氮平均降解率30.1%，總磷平均降解率9.8%。由此可見，微生態制劑對養殖水體有明顯的凈化作用。

2.2.3養殖收益分析。

由表7可知，經過3個月的養殖，微生態制劑組成品蝦規格要略高于對照組，且產量較高，由此帶來的養殖收益較對照組提高了18.7%。

3討論

3.1微生態制劑對凡納濱對蝦生長及消化酶活力的影響

陳曉瑛等[12]認為在凡納濱對蝦日糧中添加芽孢桿菌能夠提高對蝦機體腸道內消化酶活性的主要原因是芽孢桿菌進入機體腸道后能夠產生大量的胞外酶，如淀粉酶和蛋白酶等，增加了腸道內消化酶的數量，2種不同來源的消化酶產生的協同作用，使對蝦腸道內消化酶活性得到了提高。丁賢等[13]研究表明，在凡納濱對蝦基礎飼料中添加芽孢桿菌，可顯著提高對蝦消化酶活性和成活率，有助于飼料的消化吸收，促進對蝦生長。柴俊等[14]發現乳酸菌的主要代謝產物是乳酸，其次還有一些揮發性脂肪酸，能夠降低機體腸道內的pH，從而可以達到抑制致病菌生長繁殖的作用。同時，它還具有細胞表面的蛋白抗原和黏液黏附受體蛋白等生理生化特征，已經作為益生菌廣泛應用于陸生動物和魚類養殖[15]。此外，乳酸菌能使無菌動物和常規小鼠腸道絨毛膜層細胞增殖，也能通過提高腸上皮細胞的成活率使腸道黏膜層的損傷修復[16]。該研究比較了在飼料中添加不同水平的側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和干酪乳桿菌對凡納濱對蝦生長及消化酶活性的影響。結果表明，試驗組凡納濱對蝦存活率、增重率、攝食率和餌料系數顯著高于對照組（P<005），并且能有效提高對蝦腸道內消化酶的活力，使其能更好的吸收營養物質，促進機體的生長。

3.2微生態制劑對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響

凡納濱對蝦主要依靠非特異性免疫系統來抵抗外界的病原菌和疾病的侵染，維護機體的正常生長[17]。其中，體內所含的超氧化物歧化酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶等活性是主要的評價指標[18]。胡毅等[19]研究表明，益生菌及其代謝產物能夠提供良好的免疫激活劑，并通過激發機體的非特異性免疫來增強機體的抗病能力。其作用機理可能是通過細菌本身或細胞壁成分刺激非特異性免疫系統使其發揮作用，從而提高動物免疫力[20]。該研究通過正交試驗比較了不同微生態制劑對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響，綜合3因素不同水平的結果，篩選出添加量的最優組合方案，即LK（干酪乳桿菌）107 CFU/mL、NJ（側孢芽孢桿菌）106 CFU/mL、JXCB-2（地衣芽孢桿菌）107 CFU/mL。

3.3微生態制劑對水質的影響

養殖水體環境惡化是目前水產養殖業面臨的主要問題之一，高密度養殖凡納濱對蝦，導致養殖后期水質污染嚴重，大量殘余餌料以及動物的糞便和尸體成為了主要污染源，而其主要成分是蛋白質和淀粉。謝航等[21]、杭小英等[22]研究表明，地衣芽孢桿菌能在適宜的養殖水體水質條件下降解蛋白質與淀粉。同時芽孢桿菌本身也具有良好的脫氮去磷效果，如枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌具有明顯去除氨氮和亞硝酸氮的功能[23]，在養殖水體中使用芽孢桿菌能有效降低水體中化學需氧量、氨氮和亞硝酸鹽等有害物質，并將其轉化為二氧化碳、硝酸鹽和磷酸鹽等[24-26]，從而為大量藻類生長繁殖提供其必需的營養，而這些藻類又能通過光合作用為水體提供氧氣，從而形成一個良好的生態循環。干酪乳桿菌菌體能產生乳酸、抗菌肽等物質，能夠抑制病原菌的生長，且能在養殖水體中直接或間接分解有機質和亞硝酸鹽等物質。宋蓉等[27]研究表明干酪乳桿菌去除亞硝酸鹽的機理包括胞內酶作用、代謝產物乳酸的直接化學反應作用和間接促進微生物反硝化作用3種作用機理，并闡述了其在養殖水體中主要以間接作用方式發揮作用，認為乳酸促進反硝化作用的原因在于為反硝化微生物提供了易于利用的有機碳源。該研究在凡納濱對蝦養殖水體中潑灑不同水平的側孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和干酪乳桿菌。結果表明，盡管不同水平的3種微生物制劑對水體的凈化程度不同，但整體上均優于對照組。經過正交試驗優化了組合方案后潑灑于養殖池塘中，發現其對COD、氨氮、亞硝酸鹽氮、總氮和總磷等均有不同的降解效果，并能有效提高凡納濱對蝦的養殖效益。

3.4微生態制劑的發展前景

目前，國內水產養殖業中運用較廣泛的有光合細菌、芽孢桿菌、乳酸菌、EM制劑等，這些微生態制劑在改善水質和作為飼料添加劑等方面已取得較好的效果。齊欣等[28]提出運用基因工程相關技術對優良菌種進行遺傳改造，導入有效基因如必需氨基酸合成酶基因、疫苗基因等，并通過微膠囊技術對其進行包埋，使其在對蝦養殖過程中發揮更好的作用。徐升[29]指出細菌和酵母菌是主要對養殖廢水具有降解活性的微生物，而酵母菌是一種環境友好菌群，對環境更具安全性，且對有機污染物具有更強的耐受性，酵母菌作為將來的微生態制劑、飼料中的微生物添加劑和養殖水體的微生物調控劑都具有廣闊前景。總而言之，微生態制劑在凡納濱對蝦養殖中被廣泛地運用并用來替代抗生素將成為必然的發展趨勢，且為凡納濱對蝦的綠色養殖提供了更為廣闊的發展空間。

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