老鼠簕生物堿A對大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用及其機制研究

徐萬鵬 梁英琴 韋秀桂 王紅園 張華 周煥芳 林興 林軍

摘 要 目的：研究老鼠簕生物堿A（HBOA）對大鼠非酒精性脂肪肝的改善作用及其機制。方法：將SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、水飛薊賓膠囊組（陽性對照，26.25 mg/kg）和HBOA高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），每組10只。除空白對照組喂養普通飼料外，其余各組大鼠連續喂養高脂飼料8周以復制非酒精性脂肪肝模型。于第9周起，空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積0.6%羥甲基纖維素鈉溶液，各給藥組大鼠灌胃相應藥物，每日1次，連續4周。觀察各組大鼠一般情況并計算其體質量增量、臟器（肝、腎、脾）指數;檢測肝組織中天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（NEFA）含量，以及血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量;采用免疫組織化學法檢測肝組織中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）蛋白的表達情況。結果：與空白對照組比較，模型組大鼠體質量增量和肝指數均顯著升高（P<0.01）;肝內可見脂肪沉積現象，血清中SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量以及肝組織中AST、ALT、TC、TG、NEFA含量均顯著升高，PPARα蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠體質量增加量和肝指數均顯著降低（P<0.05或P<0.01），肝內脂肪沉積現象改善，血清中SOD、GSH-Px活性（除HBOA低劑量組外）均顯著升高，MDA含量以及肝組織中AST、ALT、TC（除HBOA低劑量組外）、TG（除HBOA低劑量組外）、NEFA含量均顯著降低，PPARα蛋白表達水平（除HBOA低劑量組外）均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且高劑量組上述部分指標顯著優于中、低劑量組（P<0.05）。結論：老鼠簕生物堿A對高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪肝有一定的改善作用，其機制可能與改善脂質代謝紊亂、抗氧化應激及上調PPARα表達有關。

關鍵詞 老鼠簕生物堿A;大鼠;非酒精性脂肪肝;氧化應激;脂代謝紊亂

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study improvement effect and mechanism of ilicifoliosids alkaloid A （HBOA） on non-alcoholic fatty liver disease in rats. METHODS： SD rats were randomly divided into blank control group， model group， Silybin capsule group （positive control， 26.25 mg/kg）， HBOA high-dose， medium-dose and low-dose groups （100， 50， 25 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except that blank control group fed normal feed， the other groups were continuously fed with high-fat diet for 8 weeks to induce non-alcoholic fatty liver disease model. Form the 9th week， blank control group and model group were given constant volume of 0.6% CMC-Na solution， and administration groups were given corresponding drugs by intragastric admini- stration， once a day， for consecutive 4 weeks. The general information of rats were observed and the body weight increase， organ （liver， kidney and spleen） indexes were calculated; the contents of AST， ALT， TC， TG and NEFA in liver tissue were detected， and SOD， GSH-Px activities and MDA content in the serum were also determined. The protein expression of PPARα in liver tissue was detected by immunohistochemistry. RESULTS： Compared with blank control group， the body mass increase and liver index of rats in model group were increased significantly （P<0.01）; fat deposition could be observed in the liver; the activities of SOD and GSH-Px in serum were reduced significantly， and the contents of MDA， the contents of AST， ALT， TC， TG and NEFA in liver tissue were significantly increased， and the protein expression of PPARα was decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the body mass increase and liver index of the rats were decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）， liver fat deposition was improved， the activity of SOD and GSH-Px in serum （except for HBOA low-dose group） were increased significantly while MDA content， the contents of AST， ALT， TC （except for HBOA low-dose group）， TG （except for HBOA low-dose group） and NEFA in liver tissue were decreased significantly， while protein expression of PPARα was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Some of the above indexes of HBOA high-dose group were significantly better than HBOA medium- and low-dose group （P<0.05）. CONCLUSIONS： HBOA has a certain improvement effect on non-alcoholic fatty liver disease in rats caused by high-fat diet， and its mechanism may be related to improving lipid metabolism disorders， anti-oxidative stress and up-regulating the expression of PPARα.

KEYWORDS? ?Ilicifoliosids alkaloid A; Rat; Non-alcoholic fatty liver disease; Oxidative stress; Lipid metabolism disorder

隨著人們膳食水平的提升，非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病率呈逐年上升趨勢，對人們身體健康造成嚴重的危害[1-3]。NAFLD最初由Ludwig J等學者提出，是指除過量飲酒以外的其他因素所致肝細胞彌散性脂肪變性與脂質累積的一類疾病，其可由單純脂肪肝變性演變而成，進一步進展為肝纖維化、肝硬化及肝癌[4-5]。NAFLD致病機制十分復雜，至今尚不明確，但越來越多的研究指出，經典的“二次打擊”學說在一定程度上可解釋NAFLD的發生發展，包括“一次打擊”學說中的肥胖、脂質代謝紊亂、2型糖尿病等引起的胰島素抵抗[6]，以及“二次打擊”學說中的氧化應激和脂質過氧化反應，均可造成大量的氧自由基生成，反向加重肝細胞損傷[7]。因此，積極探索延緩NAFLD病情進展的干預方法對后續闡明其發病機制具有重要的臨床指導意義。

紅樹林植物老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）是一種分布于熱帶海岸地區的爵床科老鼠簕屬植物，又名軟骨牡丹、老鼠怕，其味微咸、性涼，具有消腫散結、涼血清熱、解毒之功效，且民間將其用于治療肝炎、肝脾腫大、淋巴結腫大等癥的歷史悠久[8-11]。本課題組前期已從老鼠簕屬植物中分離出一個活性單體化合物——老鼠簕生物堿A[4-hydroxy-2（3H）-benzoxazolone，HBOA]，并已成功合成。藥理實驗表明，HBOA具有較好的保肝和抗氧化作用[12-13]，然而其對NAFLD是否也具有改善作用目前尚未可知。因此，本文研究了HBOA對大鼠NAFLD的改善作用，并初步探討了其作用機制，旨在為進一步明確HBOA的藥理作用及其臨床合理應用提供有力的數據支撐。

1 材料

1.1 儀器

SpectraMaxPlus384型掃描式酶標儀（香港分子儀器有限公司）;EG11501-1型快速組織包埋機、RM2255型全自動輪轉切片機（德國Leica公司）;BX53型正置光學顯微鏡（日本Olympus公司）;TV-1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;KZ-Ⅱ型高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）;Micro17R小型高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 藥物與試劑

HBOA（由廣西醫科大學藥學院藥物化學教研室合成，批號：20170321，純度：>99%）;水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號：950701001，規格：35 mg）;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，西隴科學股份有限公司，批號：1903052）;生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司，批號：L119101501）;水合氯醛（成都市科隆化學品有限公司，批號：2017091901）;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（NEFA）酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20190516、20190712、20190624、20190627、20190627、20190718、20190829、20190718）;兔過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AI10115187）;大鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒（美國Proteintech Group公司，批號：30202003）;山羊血清封閉液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：19110701）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：010719190603）;蘇木精-伊紅（HE）染色液（北京雷根生物技術有限公司，批號：0904A18）;二甲苯、乙醇均由廣西中醫藥研究院中藥藥理所免疫組化實驗室提供;其余試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.3 動物

60只健康雄性SD大鼠，SPF級，4周齡左右，體質量（120±20） g，來自于廣西醫科大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。高脂飼料（配方：81.5%基礎飼料、3%膽固醇、0.5%三號膽鹽、5%蛋黃粉、10%豬油）購自北京博愛港商貿有限公司。所有大鼠均飼養于室溫（23±2） ℃、濕度（50±10）%、每12 h明暗交替的環境下，并自由攝食和飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

60只大鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白對照組、模型組、水飛薊賓膠囊組（陽性對照，26.25 mg/kg，劑量設置源于文獻方法[14]）和HBOA高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg，劑量設置按照本課題組前期實驗結果[15]），每組10只。除空白對照組大鼠給予普通飼料外，其余各組大鼠連續喂養高脂飼料8周以復制NAFLD模型。待第8周結束后，隨機選取1只空白對照組大鼠和3只造模大鼠，取其肝組織做病理學檢查，HE染色結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肝細胞出現嚴重的脂肪變性，脂肪空泡明顯且呈氣球樣變，匯管區存在明顯的炎性和嗜酸性壞死細胞。上述病理特征變化表明NAFLD模型復制成功。從第9周起，每組隨機保留8只大鼠，給藥組灌胃相應藥物（以0.6%CMC-Na溶液作為溶劑，臨用新配），空白對照組和模型組灌胃等體積0.6%CMC-Na溶液，每日1次，連續4周。

2.2 標本采集、形態觀察與臟器指數檢測

給藥期間，每日觀察各組大鼠的一般情況，包括精神狀態、飲食、活動狀況等。末次給藥當晚禁食10 h、不禁水，于次日清晨，稱取大鼠體質量，與實驗前體質量比較，計算體質量增量;腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，于腹主動脈取血后，迅速剖離肝、腎、脾，經冰冷生理鹽水漂洗除去血跡，吸掉表面液體后，觀察形態，稱取濕質量，計算相應臟器指數，臟器指數=臟器濕質量（g）/ 體質量（g）×100%。全血經靜置后，以3 500 r/min離心15 min，取上清液;每只大鼠均于左葉相同部位切取約1 cm×1 cm×1 cm的組織，固定在4%多聚甲醛溶液中。上述樣本均于-80 ℃環境下分裝保存。

2.3 肝組織中AST、ALT、TC、TG、NEFA含量檢測

采用ELISA檢測，按試劑盒說明書方法操作：取各組大鼠肝組織適量，用生理鹽水作為勻漿介質，按照1 ∶ 9（g/mL）的比例制備肝組織勻漿液，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，取上清液，使用酶標儀檢測AST、ALT、TC、TG、NEFA含量。

2.4 血清中SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測

采用ELISA法檢測，按試劑盒說明書方法操作：取各組大鼠血清適量，使用酶標儀檢測SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

2.5 肝組織中PPARα蛋白表達檢測

利用免疫組織化學法檢測，按照抗體及免疫組化試劑盒說明書方法操作：取肝組織適量，經石蠟包埋后，切成厚度為5 μm的切片，先將切片置于二甲苯中進行脫蠟，再依次用100%、95%、80%、60%乙醇進行水化;然后進行抗原修復、內源性過氧化物酶滅活、10%山羊血清封閉，滴加PPARα一抗（稀釋比例1 ∶ 400），4 ℃孵育過夜;次日用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4～7.6）清洗3次，每次1 min，滴加對應生物素標記的抗兔/鼠辣根過氧化物酶標記聚合物，37 ℃孵育30 min后，PBS清洗3次，每次1 min;滴加DAB工作液顯色，用水清洗后，經蘇木精復染2 min，乙醇脫水，置于二甲苯中透明2次，每次10 min，干燥后，用中性樹脂封片，置于光學顯微鏡下拍照（棕黃色區域表示陽性），每張照片隨機拍攝5個視野（×200），利用Image Pro plus 6.0軟件進行分析，以組化圖中的累積光密度值占總區域的比值表示PPARα蛋白的表達水平。

2.6 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析。計量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗（方差齊）或Dunnetts T3檢驗（方差不齊）。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 HBOA對NAFLD模型大鼠一般情況的影響

空白對照組大鼠毛色光澤，食欲旺盛，精神狀態良好。模型組大鼠毛色乏黃且暗淡，精神萎靡，懶動，不活潑。與模型組比較，水飛薊賓膠囊組和HBOA各劑量組大鼠精神狀態均有改善。

3.2 HBOA對NAFLD模型大鼠體質量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠體質量增量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠體質量增量均顯著降低，且HBOA高劑量組顯著低于HBOA低劑量組（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠體質量測定結果見表1。

3.3 HBOA對NAFLD模型大鼠臟器的影響

空白對照組大鼠肝臟為紅褐色，表面光滑，邊緣銳利，形態正常;模型組大鼠肝臟為灰黃色，表面觸之伴有油膩感，邊緣較鈍且腫大，有花斑塊形成，部分可見少量白色脂肪沉積;各給藥組大鼠肝臟色澤逐漸恢復正常，上述肝脂變程度得到明顯改善。與空白對照組比較，模型組大鼠肝指數顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝指數均顯著降低（P<0.05或P<0.01），HBOA各劑量組肝指數組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。此外，各組大鼠腎、脾臟色澤、形態均無明顯變化，腎指數和脾指數組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠臟器指數測定結果見表2。

3.4 HBOA對NAFLD模型大鼠肝組織中AST、ALT含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中AST、ALT含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中AST、ALT含量均顯著降低，且HBOA高劑量組顯著低于HBOA中、低劑量組（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠肝組織中AST、ALT含量檢測結果見表3。

3.5 HBOA對NAFLD模型大鼠肝組織中TC、TG、NEFA含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中TC、TG、NEFA含量均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，水飛薊賓膠囊組和HBOA高、中劑量組大鼠肝組織中TC、TG含量以及各給藥組大鼠肝組織中NEFA含量均顯著降低，且HBOA高劑量組均顯著低于HBOA中、低劑量組（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠肝組織中TC、TG、NEFA含量檢測結果見表4。

3.6 HBOA對NAFLD模型大鼠氧化應激指標的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，水飛薊賓膠囊組和HBOA高、中劑量組大鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），但上述指標組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠血清中SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測結果見表5。

3.7 HBOA對NAFLD模型大鼠肝組織中PPARα蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肝組織中PPARα蛋白的表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中PPARα蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），但組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。各組大鼠肝組織中PPARα蛋白表達的免疫熒光顯微圖見圖1，蛋白表達水平檢測結果見圖2。

4 討論

NAFLD是一種以肝細胞脂質過度蓄積為特征的慢性肝臟疾病[16]。近年來，學者們為深入研究NAFLD的致病機制，成功建立了多種造模方法，主要包括營養失調型、轉基因改良型及藥物和毒物損傷型[17]。其中，營養失調型中的高脂飲食法較貼近于人類NAFLD的發生過程，且造模成功率高、死亡率低、重復性強且操作簡單，故本研究采用此方法復制NAFLD動物模型。已有研究表明，HBOA有較好的護肝和抗炎效果，對四氯化碳（CCl4）誘導肝纖維化模型大鼠的改善作用呈劑量依賴性[9-10]，但在NAFLD方面的干預效果尚不明確。另有研究顯示，水飛薊賓膠囊對NAFLD模型大鼠有明顯的改善作用[18]。基于上述理論與研究基礎，本研究在建立NAFLD大鼠模型的基礎上，以水飛薊賓膠囊為陽性對照，初步探討了HBOA對大鼠NAFLD的改善作用及其機制。

常用于反映肝損害程度的酶學指標有AST、ALT。當肝細胞受到損傷后，會引起細胞內AST、ALT流入血液中，使外周血中轉氨酶含量顯著上升，且不同類型肝病所致轉氨酶含量上升的程度也有明顯差異[19]。SOD和GSH-Px是細胞內天然的抗氧化物酶，能清除生物的體內氧自由基，提升機體抗氧能力并阻斷生物體內脂質過氧化反應進程[20]。有研究表明，持續的氧化應激反應會降低體內SOD、GSH-Px活性，從而導致脂質過氧化代謝產物MDA含量升高，引起肝細胞變性、凋亡，其含量高低可間接反映肝臟的受損程度[21]。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量和肝組織中AST、ALT活性均顯著升高，表明大鼠的肝功能受到了破壞;經HBOA治療后，大鼠血清中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，MDA含量以及肝組織中AST、ALT活性均顯著降低，這表明HBOA對高脂飲食所致的大鼠肝損害有一定的改善作用。

機體發生脂質代謝的主要部位在肝臟。PPARs是由配體激活的核轉錄因子，屬于核甾體激素受體超家族中的一員[22]。根據其亞型的特異性及在不同生理部位中表達水平的不同，可分成PPARα、PPARβ、PPARγ。其中，PPARα高表達于肝臟、心臟及骨骼肌等脂代謝能力較強部位，而在其余脂代謝能力較弱部位則呈低表達[23]。近來研究發現，胰島素抵抗是引起脂質代謝紊亂的首要原因之一[24-26]。在該狀態下，肝中TG、TC、NEFA等合成與降解平衡失調，且隨著時間的推移，大量脂肪堆積于肝臟內，導致肝細胞損傷，最終引發NAFLD。然而，由于NAFLD患者體內脂質異常堆積，引起肝腫大，肝細胞脂肪變性、脂質代謝紊亂，降低機體對胰島素的靈敏性，進一步加重胰島素抵抗[27-28]。而PPARα是能調節胰島素敏感性的一個重要轉錄因子，并且活化的PPARα能夠降低患者胰島素抵抗的發生概率，故可延緩NAFLD患者的病情進展[29]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠體質量增量、肝指數及肝組織中TC、TG、NEFA含量均顯著升高，表明高脂飲食能使大鼠發生脂代謝紊亂。經HBOA治療后，大鼠體質量增量、肝指數及肝組織中TC、TG、NEFA含量均顯著下降，表明HBOA可以有效改善大鼠的脂代謝紊亂狀態。此外，免疫組化結果顯示，空白對照組大鼠肝組織中PPARα蛋白的表達水平很高，模型組大鼠肝組織中PPARα蛋白的表達水平顯著降低;經HBOA治療后，大鼠肝組織中PPARα蛋白的表達水平顯著升高，表明HBOA可通過上調PPARα蛋白的表達來發揮對NAFLD的治療作用。

綜上所述，HBOA對高脂飲食所致大鼠NAFLD有一定的改善作用，其機制可能是通過改善脂質代謝紊亂、調節氧化應激、上調PPARα蛋白表達等有關，本文為HBOA防治NAFLD的后續研究開拓了新的思路。但NAFLD致病機制極其復雜，更加具體的治療靶點及機制還有待進一步探討。

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（收稿日期：2020-05-09 修回日期：2020-06-07）

（編輯：鄒麗娟）