食管癌組織中PD-L1、Vim、Zeb1的表達與放療敏感性的關系分析

付江萍 藍柳 胡芳 方向東 高友淑 莫玉珍

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常見消化道惡性腫瘤，部分腫瘤細胞對放療敏感性較低，5年生存率僅為約10%［1-2］。上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）與食管癌發病、侵襲和轉移密切相關，是影響食管癌細胞放療敏感性的重要因素［3］。程序性死亡受體配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）、波形蛋白（Vimentin，Vim）及鋅指結構E-box 結合蛋白1（zinc finger E-box-binding protein，Zeb1）均可在調控EMT 過程中發揮重要作用，信號傳導和轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）可能為其關鍵作用通路［4-6］。本文主要分析EC 患者癌組織中PD-L1、Vim 及Zeb1 表達水平及其與放療敏感性的關系，為促進EC 治療水平不斷進步提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月至2019年10月本院收治的中晚期EC 患者106 例為樣本進行研究，其中男性61 例、女性45 例，年齡39～82 歲，平均（54.91±10.37）歲，AJCC 分期［6］Ⅱ期37 例、Ⅲ期51 例、Ⅳ期18 例。納入標準：①經輔助檢查確診為EC；②患者年齡≥18 歲；③AJCC 分期為Ⅱ～Ⅳ期；④患者及家屬知情并同意本研究內容。排除標準：①合并其它類型惡性腫瘤；②合并重要器官功能不全；③合并精神疾病或交流溝通障礙；④患者不了解自身病情；⑤此前已接受抗腫瘤治療者。本研究經本院倫理委員會審核批準。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器和試劑

采用切片機（德國徠卡公司，型號：RM 2245）、載玻片和蓋玻片（北京鼎國生物技術公司）、超低溫冰箱（Haier 公司，型號：DW-86W100）、PD-L1、STAT3 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號：sc1724M、sc2186R）、Vim 抗體（Abcam 公司，批號：ab6194）、Zeb1 抗體（Abcam 公司，批號：ab8239）、免疫組化和DAB 顯色試劑盒（福州邁新公司）、磷酸鹽緩沖液（福州邁新公司）、多聚甲醛（蕪湖海峰化工）、抗原修復液（福州邁新公司）。

1.2.2 免疫組化方法

將EC 標本石蠟包埋切片并以72℃烘烤4 h，冷卻后以二甲苯脫蠟、乙醇脫水和蒸餾水沖洗，采用PH 為6.0 的0.01 M 檸檬酸鹽在高溫高壓條件下進行抗原修復，依次采用蒸餾水和鹽酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，4% H2O2封閉35 min 后再次以蒸餾水和PBS 沖洗，然后滴加一抗并于4℃下孵育24 h，PBS 沖洗后依次滴加免疫組化試劑盒試劑1 和試劑2，分別孵育40 min 并以PBS 沖洗3 次，每次5 min，然后滴加新配置的DAB 顯色劑染色并采用蒸餾水沖刺3 次，每次5 min，采用蘇木素復染1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后由兩名經驗豐富的病理科醫師開始鏡檢。每例標本分別選擇10 個高倍鏡視野進行觀察，PD-L1定位于包膜或者胞質并表現為棕黃色顆粒，Vim、Zeb1 和STAT3 均為胞質中顯示棕黃色或黃褐色顆粒，陽性對照均為已知陽性的組織切片，陰性參考均為PBS。

1.2.3 數據分析

每位患者均根據國際輻射單位與測量委員會（ICRU）50 和62 號報告相關標準［7］進行放療，完成后第4 周行食管鋇餐造影檢查，根據實體瘤反應評價標準（RECIST）評估近期療效［8］將患者兩組并比較腫瘤組織中PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性表達率，然后分析影響EC 放療敏感性的因素及PD-L1、Vim 和Zeb1 與STAT3 表達水平的相關性。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 軟件，計數資料采用n（%）表示，兩組間對比進行χ2檢驗，采用Logistic回歸分析研究PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性率對EC 患者放療敏感性的影響，采用Spearman 系數進行相關性分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC 病理結果及PD-L1、Vim、Vim、Zeb1 和STAT3 表達情況

根據陽性細胞百分比和染色強度進行評分，染色強度按照未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色和分別計0～3 分；陽性細胞占比為零計0 分，≤25%計1 分、25%～50%計2 分、50%～75%計3 分、＞75%計4 分；總分為兩者得分相乘，以總分0～2 分為陰性，≥3 分為陽性，見圖1。

2.2 兩組EC 患者臨床病理特征比較

106 例EC 患者均順利完成放療計劃，其中CR 為37 例（34.91%），PR 為34 例（32.08%），SD為23 例（21.70%），PD 為12 例（11.32%），放療敏感71 例，占比56.35%，敏感組和耐受組腫瘤最大徑和分化程度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 兩組EC 患者PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性率比較

敏感組PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性率均低于耐受組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 兩組EC 患者臨床病理特征比較［n（%）］Table 1 Comparison of clinicopathological characteristics between the two groups of EC patients［n（%）］

表2 兩組EC 患者PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive rates of PD-L1，Vim，Zeb1 and STAT3 in EC patients between the two groups［n（%）］

圖1 EC 病理結果及PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 表達情況（HE）Figure 1 EC pathological results and expressions of PD-L1，Vim，Zeb1 and STAT3（HE）

2.4 PD-L1、Vim 和Zeb1 與STAT3 相關性分析

EC 患者腫瘤組織PD-L1、Vim 和Zeb1 陽性率與STAT3 均具有明顯正相關性（P＜0.05），見表3。

表3 PD-L1、Vim 和Zeb1 與STAT3 相關性分析Table 3 Correlation between PD-L1，Vim and Zeb1 and STAT3

2.5 影響EC 放療敏感性的多因素Logistic 回歸分析

腫瘤最大徑＞1.5 cm、分化程度低以及PD-L1、Vim、Zeb1 和STAT3 陽性為影響EC 放療敏感性的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

3 討論

腫瘤細胞侵襲和轉移是造成EC 患者預后不良的主要原因，其中EMT 為重要作用機制，主要表現為E-cadherin 等上皮細胞標志物減少而Vim 等間質細胞標志物表達水平增加［9］。文獻報道顯示PD-L1表達增加可促進E-cadherin 下調，轉錄因子Slug 和Twist 上調并參與調節EMT 過程，同時對T、B 淋巴細胞免疫功能造成明顯影響并誘導免疫逃逸發生，此外，現已證實Zeb1 在乳腺癌等腫瘤組織中異常表達，并通過EMT 促進腫瘤侵襲和轉移發生［10-11］。

表4 影響EC 放療敏感性的多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of EC radiosensitivity

最新研究認為EMT 是影響惡性腫瘤細胞放療敏感性的重要原因，而PD-L1、Vim 和Zeb1 表達水平均與EMT 關系密切，因此PD-L1、Vim 和Zeb1可能對EC 放療敏感性產生影響［12］。本研究結果結果，提示檢測PD-L1、Vim 和Zeb1 表達情況有利于判斷EC 對放療敏感性，從而為臨床選擇合理治療方案提供參考信息。

STAT3 受細胞外信號激活后發生磷酸化為p-STAT3，并通過與特定靶基因啟動子結合而參與調控與細胞增殖、分化和凋亡等活動相關的基因表達，在腫瘤發生、侵襲及轉移過程中發揮重要作用［13］。本研究顯示放療敏感組EC 患者STAT3 明顯高于耐受組，進一步分析發現STAT3 陽性為影響放療敏感性的獨立危險因素，可見STAT3 在EC放療耐受過程中發揮重要作用，與Lee 等［14］報道結果一致。文獻報道STAT3 調節放療敏感性的機制可能包括上調血管內皮生長因子表達（VEGF），活化缺氧誘導因子-1（HIF-1）及調控細胞周期蛋白D等［3］。Zhang 等［15］和Cortez 等［16］研究發現放射治療可誘導炎癥因子釋放并促使STAT3 磷酸化，上調PD-L1 表達水平并形成治療誘導的放射抗拒。同時有研究認為Zeb1 為JAK/STAT3 信號通路重要環節且在調節E-cadherin 和Vim 等蛋白表達及EMT 過程中發揮關鍵作用［17］。本研究結果推測PD-L1、Vim 和Zeb1 均可能參與調節JAK/STAT3信號通路，從而影響腫瘤細胞EMT 及放療敏感性，由于條件限制本研究未對PD-L1、Vim 和Zeb1陽性率與STAT3 表達水平進行量化分析，故具體結果還有待更多研究進行探討和證實。

綜上所述，EC 腫瘤組織PD-L1、Vim 和Zeb1陽性率在放療耐受患者中明顯升高，且與STAT3表達水平具有明顯正相關性，可能是影響EC 放療敏感性的重要原因。