星形細胞腫瘤組織EGFR、VEGF表達及其與病理分級的相關性研究

張弛 袁健 彭剛 謝源陽 蘇軍 劉慶 袁賢瑞 李昊昱

腦星形細胞瘤是最為常見的中樞神經上皮性腫瘤，臨床數據顯示其占顱內腫瘤的20%左右，占膠質瘤的21～50%左右［1］。國際健康組織根據其生物學行為將其分為4 級，其中Ⅰ級為毛細胞星形細胞瘤，Ⅱ級為彌漫性星形細胞瘤；Ⅲ級為間變惡性星形細胞瘤，Ⅳ級為膠質母細胞瘤［2］。腦星形細胞瘤可發生在中樞神經系統的各個部位，多見于成人大腦。目前對于腫瘤的研究顯示，癌基因或抑癌基因的異常表達往往與腫瘤的發生相關，而影響腫瘤的生長、轉移不僅依賴腫瘤的增殖，同時與腫瘤內的血管新生密切相關［3-4］。上皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，RGFR）是上皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）細胞增殖和信號傳導的受體，與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關［5］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用［6］。本文旨在探討EGFR、VEGF 的表達與星形細胞瘤患者臨床病理分級的相關性，為星形細胞瘤的治療提供新的方向。現報到如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年1月間本院經病理學檢查確診的98 例星形細胞腫瘤患者為研究對象，其中男性57 例，女性41 例；患者平均年齡（42.68±5.39）歲；根據WHO中樞神經系統腫瘤分級標準［7］，Ⅰ級22例，Ⅱ級24 例，Ⅲ級28 例，Ⅳ級24；腫瘤大小：≥5 cm 47 例，＜5 cm 52 例；腫瘤部位：幕上部位52 例，幕下部位46 例；惡性程度：低53 例，高45 例；浸潤深度T1～2 共41 例，T3～4 共57 例。50 例正常腦組織中，男性28 例，女性22 例，平均年齡（43.1±5.4）歲。

納入標準：①患者經病理學、影像學首次確診為腦星形細胞腫瘤患者；②入院治療前未接受放療、化療、手術、靶向藥物等治療；③患者同意接受星形細胞腫瘤根治術治療；④臨床資料完整，治療依從性良好；⑤身體狀況相對良好，能夠耐受根治性手術治療；⑥患者熟知本課題研究方案簽署知情同意書自愿參與研究。排除標準：①合并有其他腫瘤；②合并有其他器官功能異常及嚴重心血管疾病；③患有先天性腦損傷或腦部疾病；④存在用藥過敏、治療不耐受或禁忌癥的患者。經醫院倫理委員會通過后展開實施。

1.2 試劑及儀器

兔抗人EGFR 抗體購自美國Proteintech Group公司，貨號：18986-1-AP；兔抗人VEGF 抗體購自美國Proteintech Group 公司，貨號：19003-1-AP；HRP標記的羊抗兔Ig G 抗體購自中國碧云天生物公司，貨號：A0208；圖像采集成像系統（chemi-DocTm）及圖像分析系統（Quantity One 1-D 分析軟件）購自美國Bio-Rad Laboratories 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化分析

將腫瘤組織、癌旁正常組織及正常腦組織經石蠟包埋后連續切片，固定于載玻片上，50℃烘箱中烘1 h 后，二甲苯、100%、95%、80%及75%乙醇依次進行水化，蒸餾水洗滌3 次，然后置于檸檬酸鈉溶液中加熱2 次，每次8 min，自然冷卻，PBS 洗滌2 次。3% H2O2溶液中浸10 min，阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS 洗滌3 次后，滴加MAP4 抗體稀釋液，4℃孵育過夜。PBS 洗滌3 次后用羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次，免疫組化染色，蘇木精復染，0.1%HCl 分化，藍化，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.3.2 結果判斷分析

免疫組化結果評估由兩名專業病理人員采用雙盲法進行判定，每張組織切片高倍鏡下隨機選取5 個視野區，進行獨立進行半定量積分的判斷，結果一致則記錄結果；不一致則由2 人相同意見或第3位更加權威的醫師確定。顯微鏡下觀察組織細胞，細胞質中出現黃色或棕色顆粒為顯色。評分準則［8］：按染色面積分為：0 分、1 分、2 分、3 分。依照染色深淺分為：無染色為0 分；微弱染色為1 分；中度染色為2 分；強染色為3 分。最終得分=染色面積得分×染色深淺得分，＞4 分定義為陽性高表達。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗；EGFR、VEGF 表達水平間的相關采用Spearman 相關性分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR、VEGF 在腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達情況

EGFR、VEGF 蛋白在星形細胞腫瘤組織中的陽性表達率及表達水平均明顯高于癌旁正常組織和正常腦組織（P＜0.05），癌旁正常組織和正常腦組織中EGFR、VEGF 蛋白陽性表達率比較，差異無統計學差異（P＞0.05）。見表1，圖1。

2.2 EGFR、VEGF 在星形細胞腫瘤組織中的表達與臨床病理參數關系

星形細胞腫瘤組織中EGFR、VEGF 蛋白表達與星形細胞腫瘤的惡性程度、腫瘤大小、腫瘤分級、浸潤程度相關，差異有統計學意義（P＜0.05）；與患者的年齡、性別、腫瘤發生部位差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

圖1 EGFR、VEGF 蛋白在組織中的表達（HE，×200）Figure 1 Expression of EGFR and VEGF proteins in tissues（HE，×200）

2.3 星形細胞腫瘤組織中EGFR、VEGF表達相關性

星形細胞腫瘤組織中85 例EGFR、VEGF 共陽性表達，6 例EGFR、VEGF 共陰性表達，EGFR 單陽性1 例，VEGF 單陽性7 例；Spearman 相關性分析結果顯示EGFR 與VEGF 表達呈正相關（r=0.859，P＜0.05）。

表2 EGFR、VEGF 在星形細胞腫瘤組織中的表達與臨床病理參數關系［n（%）］Table 2 Relationship between expression of EGFR and VEGF in astrocyte tumor tissues and clinicopathological parameters［n（%）］

3 討論

EGFR 蛋白是酪氨酸激酶受體，其高表達激活的生長信號能夠通過酪氨酸激酶途徑傳遞至細胞核內，促使細胞的增殖［9］。EGFR 與其配體結合后形成二聚體，通過磷酸化酪氨酸殘基激活下游多條信號通路，誘導VEGF、FGF 蛋白表達，最終調控細胞的增殖和分化［10］。在正常情況下，機體受到外界刺激，會激活VEGF 表達，發揮增強內皮細胞有絲分裂、促進局部組織血管新生的作用，從而改善組織供血情況；在腫瘤組織中，癌細胞能通過誘導VEGF 表達，刺激腫瘤血管內皮細胞的增殖和遷移，同時改變新生血管的通透性，不僅為腫瘤的生長提供養分，還有利于腫瘤細胞的侵襲以及轉移［11］。

本研究結果顯示：癌組織中EGFR、VEGF 蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，可能是由于腫瘤細胞的生長速度較快，并且其代謝主要依靠能效較低的糖酵解途徑，因此比正常細胞需要更多的養分，而EGFR、VEGF 的高表達均能夠刺激腫瘤組織的血管新生，來為瘤組織供給足夠的養分。劉坤等［12］的研究結果表明，腫瘤組織通過高表達EGRF 促進自身生長，而高表達的EGRF 又能夠刺激VEGF 表達升高，從而促進瘤體內血管生長，為腫瘤生長提供營養，從而形成惡性循環，與本研究結果一致，提示EGFR、VEGF 可能是治療星形細胞腫瘤的有效靶向位點。本研究還進一步驗證了星形細胞腫瘤組織中EGFR、VEGF 表達的相關性，結果顯示：EGFR 與VEGF 表達呈高度正相關性，馬經偉等［13］的研究也證實，在胃腺癌中EGFR 與VEGF的表達也呈正相關，在實體腫瘤的發展過程中存在明顯的共表達現象。通過對比患者臨床資料與EGFR、VEGF 表達結果發現，星形細胞腫瘤組織中EGFR、VEGF 表達與星形細胞腫瘤的的惡性程度、腫瘤大小、腫瘤分級、浸潤程度相關；與患者的年齡、性別、腫瘤發生部位差異無統計學意義。朱衛波等［14］研究發現EGFR、VEGF 在甲狀腺乳頭狀癌中表達水平與患者的臨床病理參數相關性與研究結果基本一致，說明EGFR、VEGF 具有成為腫瘤分子靶向治療的靶點的潛在價值。

綜上所述，星形細胞腫瘤組織中EGFR、VEGF蛋白水平高表達可能是通過誘導患者腫瘤組織中的血管新生，增強養分供給促進腫瘤細胞的增殖，進而導致患者的病程持續發展。近年來分子靶向治療已成為腫瘤治療的一大熱點，本研究初步探索了EGFR、VEGF 蛋白在星形細胞腫瘤中的發生、發展過程中可能存在協同關系，但其具體機制還有待深入研究。