鼻咽癌組織中SATB1表達(dá)與化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系分析

楊和強(qiáng) 劉文峰 胡玥

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)最常見的耳鼻咽喉惡性腫瘤，中晚期NPC 患者5年生存率不超過30%［1］。NPC 轉(zhuǎn)移、放化療抵抗是其治療失敗的主要原因，所以尋找與NPC 侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并能預(yù)測(cè)放化療敏感性的基因是當(dāng)前亟需解決的問題。富含AT 序列的特異性結(jié)合蛋白1（special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1）是核基質(zhì)重要成分之一，主要表達(dá)于胸腺細(xì)胞［2］。有研究報(bào)道［3-4］，SATB1 在胃癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，但NPC 中SATB1 表達(dá)情況相關(guān)研究較少。本研究旨在分析鼻咽癌組織中SATB1 表達(dá)與NPC 臨床特征、化療耐藥及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以78 例石蠟組織標(biāo)本和新鮮癌組織（2013年1月至2015年1月本院NPC 患者）作為NPC組，其中男50 例，女28 例，年齡20～79 歲，中位年齡51 歲；依據(jù)鼻咽癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)［5］可知：Ⅰ～Ⅱ期27 例，Ⅲ～Ⅳ期51 例，病理類型：未分化型非角化性鱗狀細(xì)胞癌41 例，分化型非角化性鱗狀細(xì)胞癌30 例，角化性鱗狀細(xì)胞癌7 例。另40例石蠟組織標(biāo)本（取自同期鼻咽部慢性炎癥患者）作為對(duì)照組，其中男23 例，女17 例，年齡18～77 歲，中位年齡48 歲。2 組性別、年齡等一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①NPC 均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②術(shù)前未行放化療；③患者對(duì)本研究充分知情，并簽署病人知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②石蠟切片質(zhì)量欠佳。

1.2 主要儀器與試劑

切片機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；TK-218 型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)購(gòu)自湖北孝感市泰淮電子設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；熒光檢測(cè)儀購(gòu)自深圳市策譜科技有限公司。

鼠抗人SATB1 單克隆抗體購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；DAB 酶底物顯色試劑盒購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司；ATP 生物熒光腫瘤體外藥敏檢測(cè)（ATP-TCA）試劑盒購(gòu)自北京金紫晶生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

組織中SATB1 蛋白表達(dá)情況采用免疫組織化學(xué)Envision 二步法檢測(cè)。石蠟組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度控制在4 μm，切片脫蠟、水化處理后，進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，采用3%甲醇-H2O2溶液封閉10 min，PBS 充分淋洗。滴加山羊血清封閉10 min，然后滴加鼠抗人SATB1 單克隆抗體（1∶100 稀釋），4℃孵育過夜，PBS 充分淋洗后，滴加二抗，室溫孵育1 h，PBS 充分淋洗。DAB 顯色后，蘇木精染色10 s 左右，沖洗干凈，在不同濃度酒精（90%、95%、100%）中脫水各2 min，烘干，封片。

結(jié)果判定［6］：細(xì)胞核染色呈棕黃色的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例及細(xì)胞染色程度判斷SATB1 蛋白表達(dá)程度，無細(xì)胞染色為陰性；中等染色細(xì)胞數(shù)≤50%或強(qiáng)染色細(xì)胞數(shù)≤5%為弱陽(yáng)性；中等染色細(xì)胞數(shù)＞50%或強(qiáng)染色細(xì)胞數(shù)＞5%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 SATB1 表達(dá)水平相對(duì)定量分析

采取實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)SATB1表達(dá)水平，按照CTSATB1=CtSATB1/CtGAPDH，算出SATB1相對(duì)于GAPDH具體相對(duì)值。

1.5 腫瘤體外藥敏檢測(cè)

將新鮮的瘤體組織剪碎后進(jìn)行消化，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，腫瘤細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，制備成濃度為（2～4）×104個(gè)/孔的單細(xì)胞懸液，于96 孔板中接種（進(jìn)行平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)），12 h 后按照待測(cè)藥物臨床應(yīng)用劑量和其相對(duì)應(yīng)血漿峰值濃度（peak plasma concentration，PPC），對(duì)7 種化療藥物（順鉑、卡鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、多西他賽、吉西他賽）分別設(shè)置5 個(gè)檢測(cè)濃度的培養(yǎng)液：200.0%、100.0%、50.0%、25%、12.5% 等，對(duì)照孔不加任何藥物。將96 孔板放置在溫箱內(nèi)（5% CO2、37℃）靜置5 d 后取出，每孔加入50 μL ATP 提取液，吹打混勻后，取50 μL 混合液于微孔板中，并將50 μL 熒光酶-熒光素工作液加入其中混合均勻，在熒光檢測(cè)儀下讀取數(shù)據(jù)。

耐藥性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］：90%抑制濃度（90%inhibitory concentration，IC90）＞100% PPC 和50%抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）＞25%PPC。IC90 和IC50 分別是90%和50%腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制時(shí)的血漿峰值濃度。

1.6 隨訪

采用門診或電話方式隨訪4 個(gè)月至36 個(gè)月，記錄患者生存情況。

1.7 觀察指標(biāo)

比較NPC 組和對(duì)照組中SATB1 表達(dá)情況，分析SATB1 表達(dá)與NPC 臨床病理特征（性別、年齡、病理類型、臨床分期）、化療耐藥（順鉑、卡鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、多西他賽、吉西他賽）及預(yù)后的關(guān)系。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，兩比較使用t檢驗(yàn)，多項(xiàng)比較使用方差分析法，生存分析采用Kaplan Merier 法，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05 為比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPC 組和對(duì)照組SATB1 蛋白表達(dá)情況

NPC 組中SATB1 蛋白陽(yáng)性率為52.56%（41/78）（強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性表達(dá)為19 例、22 例），表達(dá)水平（0.198±0.036），鼻咽部慢性炎癥組中SATB1 蛋白陽(yáng)性率為12.50%（5/40）（強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性表達(dá)為1 例、4 例），表達(dá)水平（0.051±0.032），NPC 組SATB1 蛋白陽(yáng)性率與定量表達(dá)水平均明顯高于鼻咽部慢性炎癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 SATB1 蛋白表達(dá)情況Figure 1 Expression of SATB1 protein

2.2 NPC 組織中SATB1 蛋白表達(dá)與NPC 病理特征關(guān)系

NPCⅢ～Ⅳ期、T3～T4 期的SATB1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與定量表達(dá)水平分別高于Ⅰ～Ⅱ期，T1～T2 期，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），NPC N1～N3 期、M1期SATB1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與定量表達(dá)水平分別高于N0 期、M0 期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 NPC組織中SATB1蛋白表達(dá)與化療耐藥的關(guān)系

SATB1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)組對(duì)順鉑耐藥率和紫杉醇耐藥率高于SATB1 蛋白陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。順鉑與紫杉醇耐藥組SATB1定量表達(dá)水平明顯高于非耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.4 NPC 組織中SATB1 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

SATB1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)組生存率為29.64%，SATB1 蛋白陰性表達(dá)組生存率為78.20%，兩組生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），生存者SATB1定量表達(dá)水平明顯低于死亡者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

3 討論

SATB1 參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其能誘導(dǎo)許多血管形成或轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)，并抑制CD82、BRMS1、KISS1、NME1等抑癌基因表達(dá)［8］。以往研究大多關(guān)于SATB1 在乳腺癌、胃癌、肺癌、喉癌等惡性腫瘤組織中異常高表達(dá)［9］，然而在NPC 組織中相關(guān)報(bào)道較少。

表1 NPC 組織中SATB1 蛋白表達(dá)與NPC 病理特征關(guān)系［n，（±s）］Table 1 Relationship between the expression of SATB1 protein in NPC tissues and pathological features［n，（±s）］

表1 NPC 組織中SATB1 蛋白表達(dá)與NPC 病理特征關(guān)系［n，（±s）］Table 1 Relationship between the expression of SATB1 protein in NPC tissues and pathological features［n，（±s）］

臨床特征性別年齡（歲）病理類型臨床分期T 分期N 分期M 分期男女≥50＜50非角化未分化型癌非角化分化型癌角化型鱗狀細(xì)胞癌Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期T1～T2 T3～T4 N0 N1～N3 M0 M1例數(shù)（n=78）50 28 42 36 41 30 7 27 51 33 45 32 46 65 13 SATB1 陽(yáng)性（n=41）26 15 21 20 20 19 2 11 30 16 25 11 30 30 11 SATB1 陰性（n=37）24 13 21 16 21 11 5 16 21 17 20 21 16 35 2 χ2值0.018 0.240 3.251 2.315 0.382 7.200 6.427 P 值0.894 0.624 0.197 0.128 0.537 0.007 0.011 SATB1 定量表達(dá)水平0.192±0.034 0.203±0.040 0.193±0.034 0.202±0.040 0.192±0.031 0.201±0.039 0.196±0.035 0.195±0.034 0.200±0.038 0.196±0.038 0.200±0.034 0.186±0.031 0.208±0.041 0.184±0.030 0.210±0.042 t/F 值1.286 1.074 0.732 0.573 0.488 2.566 2.658 P 值0.202 0.286 0.484 0.569 0.627 0.012 0.010

表2 SATB1 蛋白表達(dá)對(duì)不同化療藥物耐藥性的影響［n（%）］Table 2 Effects of the expression of SATB1 protein on resistance to different chemotherapy drugs［n（%）］

表3 耐藥與非耐藥患者SATB1 定量表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Quantitative expression levels of SATB1 in patients with drug resistance and those without（±s）

表3 耐藥與非耐藥患者SATB1 定量表達(dá)水平比較（±s）Table 3 Quantitative expression levels of SATB1 in patients with drug resistance and those without（±s）

化療藥物順鉑卡鉑氟尿嘧啶紫杉醇環(huán)磷酰胺多西他賽吉西他賽耐藥0.211±0.033 0.203±0.041 0.204±0.039 0.215±0.042 0.201±0.040 0.199±0.036 0.202±0.037非耐藥0.184±0.035 0.193±0.031 0.192±0.033 0.181±0.030 0.195±0.036 0.197±0.036 0.194±0.035 t 值2.293 0.913 1.161 3.878 0.605 0.245 0.955 P 值0.025 0.364 0.249 0.000 0.547 0.807 0.343

圖2 Kaplan Merier 分析SATB1 蛋白表達(dá)對(duì)NPC 患者生存率的影響Figure 2 Kaplan Merier analysis of the effects of SATB1 protein expression on survival rates of patients with NPC

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)展過程中存在一種基因調(diào)節(jié)模式，SATB1 扮演著“基因組組織者”角色，可誘導(dǎo)侵襲性表型出現(xiàn)以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［10］。有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SATB1 的下調(diào)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，SATB1 表達(dá)與N 分期和M 分期密切相關(guān)，提示SATB1 表達(dá)不會(huì)影響NPC 局部浸潤(rùn)部位，但可能與NPC 侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，與上述研究觀點(diǎn)相符，從側(cè)面證實(shí)高表達(dá)SATB1 可能是NPC 發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果中提示SATB1 蛋白表達(dá)情況可一定程度上評(píng)估NPC 預(yù)后。

多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)單種化療藥物抵抗后，相繼出現(xiàn)對(duì)其他結(jié)構(gòu)功能不同化療藥物的抵抗，從而導(dǎo)致化療失敗。多藥耐藥現(xiàn)象與多藥耐藥基因、酶、腫瘤干細(xì)胞、凋亡調(diào)控基因等多種因素相關(guān)［12-14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NPC 對(duì)臨床常用化療藥物耐藥率均較低，所以臨床上采用紫杉醇+氟尿嘧啶+順鉑、吉西他濱+順鉑等治療方案對(duì)NPC 患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)有一定療效。有研究中，SATB1 表達(dá)下調(diào)可增加Caspase 活性，Caspase 作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，可通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加腫瘤細(xì)胞凋亡比例［15］。SATB1 若過量表達(dá)，則會(huì)抑制Caspase 的凋亡作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥。本研究結(jié)果提示SATB1 的高表達(dá)會(huì)使順鉑和紫杉醇耐藥率升高。SATB1 蛋白介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制可能與其抑制凋亡和誘導(dǎo)P-gp 表達(dá)升高有關(guān)。P-gp 作為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，在ATP 功能下，通過排出細(xì)胞內(nèi)藥物，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，是公認(rèn)的多藥耐藥產(chǎn)生原因之一。而有研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)SATB1 的惡性腫瘤細(xì)胞株，其P-gp 表達(dá)水平明顯升高，提示SATB1 可誘導(dǎo)P-gp過量表達(dá)，從而引起耐藥。

綜上，SATB1 在NPC 組織中呈上調(diào)表達(dá)，并且與NPC 侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥性、預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)SATB1 可促進(jìn)NPC 侵襲轉(zhuǎn)移，引起對(duì)順鉑和紫杉醇產(chǎn)生耐藥。然而SATB1 能否可作為分子治療靶點(diǎn)以降低NPC 患者對(duì)順鉑和紫杉醇耐藥性，還需進(jìn)一步深入研究。