miR-126、miR-96與急性心肌梗死患者血小板活化及近期預后相關性

劉漢毅 杜小杰 王金墻 豐貴文

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）具有高發病率、高致死率等特點，早期正確鑒別診斷AMI 對確定治療方案，改善患者預后意義重大。近年研究發現，微小核糖核酸（MicroRNAs，miRNAs）在冠狀動脈粥樣硬化血管壁炎性反應、膽固醇代謝方面起著關鍵作用，其中微小RNA-96（miR-96）證實參與冠心病發生發展［1-2］。亦有學者指出，miR96 可在上游調控血小板形成和功能，激活血小板，加劇疾病進展，影響預后改善［3］。微小RNA-126（miR-126）主要分布于內皮細胞及內皮相細胞，其水平變化與冠心病嚴重程度及預后密切相關［4］。前期研究表明上述兩種miRNAs與冠心病密切相關，但其能否成為診斷AMI 的生物標記物、診斷價值如何仍缺乏大量循證支持，鑒于此，本研究檢測AMI 患者miR96、miR-126 含量變化，分析其與血小板活化、近期預后相關性，旨在為臨床診治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月至2019年9月本院126 例行急診冠脈造影且確診為AMI 患者作為研究組，其中男71 例，女55 例，平均年齡（49.11±13.38）；收集89 例冠狀動脈造影正常的非AMI 患者作為對照組，其中男50 例，女39 例，平均年齡（50.02±12.74）。兩組性別、年齡、體質量指數（Body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、合并疾病等臨床資料比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

納入標準：①符合《內科學》中AMI 診斷標準［5］；②屬美國紐約心臟病學會（New york heart association，NYHA）分級［6］Ⅰ～Ⅲ級；發病至入院時間＜3 h；③成功施行PCI；具備一定溝通、交流能力；④患者及家屬知曉本研究，自愿簽署知曉同意書；排除標準：①腎、肝等實質性臟器器質性病變；②惡性腫瘤；③現癥感染；④既往有AMI 病史；⑤不愿參加本研究研究或隨訪受限。本研究經醫院院倫理委員會審核通過。

表1 兩組臨床資料［n（%），（±s）］Table 1 clinical data of 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組臨床資料［n（%），（±s）］Table 1 clinical data of 2 groups［n（%），（±s）］

臨床資料性別（男/女）年齡（歲）BMI（kg/m2）吸煙飲酒合并疾病高血壓糖尿病高脂血癥研究組（n=126）71/55 49.11±13.38 21.47±1.11 20（15.87）18（14.28）13（10.32）11（8.73）15（11.91）對照組（n=89）50/39 50.02±12.74 21.05±1.41 15（16.85）12（13.48）10（11.24）8（8.99）13（14.61）t/χ2值0.000 0.501 2.441 0.037 0.028 0.046 0.004 0.336 P 值0.980 0.617 0.016 0.848 0.867 0.830 0.948 0.562

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

①標本采集：早晨8：00～9：00，采集4 mL 空腹肘靜脈血，置于3.2%枸緣酸鈉真空抗凝管（1：9 抗凝），分為2 份（各2 mL），分別用于miRNAs 及血小板活化指標檢測。②miR-126、miR-96 檢測：取2 mL 血液標本放入離心機，4℃下離心15 min（4 000 r/min），分離血漿，轉移至無RNA 酶試管，參照Ambion 公司生產的TRlzol 試劑操作說明書分離miR，采用miR cDNA 第一鏈合成試劑盒將分離miR 逆轉錄為單鏈cDNA，反應體系10 μL，逆轉錄引物購自廣州銳博生物科技有限公司，以每孔1 μL 的cDNA 為模板，U6 作為內參照，應用美國ABI 7500 PCR 儀檢測2 個miRNAs 表達情況，每個樣本設置3 個復孔，反應條件為：95℃10 min預變性，40 個循環，95℃10 s，60℃20 s，72℃10 s，繪制擴增曲線，采用2-△△Ct公式計算miR-126、miR-96 表達量。③血小板活化指標：取1 mL 血液標本，選取Santa Cruz 公司生產血小板活化依賴性顆粒表面膜蛋白（CD62p）、血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復合物纖維蛋白原受體（PAC-1）的熒光抗體進行標記，應用賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產Attune NxT 流式細胞儀測定CD62p、PAC-1 含量，以陽性標記血小板百分率表示；另取1 mL 血液標本，以酶聯免疫吸附法測定血小板活化因子（PAF），試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 評估方法

以miR-126、miR-96 平均水平作為分界線，分為高miR-126、低miR-126 和高miR-96、低miR-96。

1.2.3 隨訪方法

對出院患者每3 個月進行1 次門診或住院隨訪，記錄不良心血管事件（MACE），包含非致死性心肌梗死、心力衰竭、心絞痛、血運重建。

1.3 觀察指標

①兩組miR-126、miR-96 水平。②不同miR-126、miR-96 水平患者CD62p、PAC-1、PAF 及90 d MACE發生率。③miR-126、miR-96與血小板活化指標（CD62p、PAC-1、PAF）、90 d MACE發生率相關性。

1.4 統計學處理

通過SPSS 22.0 軟件進行處理數據，計量資料以（±s）表示，行t檢驗，計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗，采用Spearman 進行相關性分析，P<0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-126、miR-96 水平

研究組miR-126 水平低于對照組，miR-96 水平高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組miR-126、miR-96 水平（±s）Table 2 miR-126 and mir-96 levels of the 2 groups（±s）

表2 兩組miR-126、miR-96 水平（±s）Table 2 miR-126 and mir-96 levels of the 2 groups（±s）

組別研究組對照組t 值P 值n 126 89 miR-96 158.89±47.38 70.29±20.42 10.179＜0.001 miR-126 86.61±24.52 342.18±75.66 35.404＜0.001

2.2 不同miR-126、miR-96水平患者血小板活化指標

低miR-126、高miR-96 患者CD62p、PAC-1、PAF 水平高于高miR-126、低miR-96 患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

2.3 miR-126、miR-96 與血小板活化指標相關性

Spearman 分析，CD62p、PAC-1、PAF 與miR-126 呈負相關，與miR-96 呈正相關，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。

表3 不同miR-126、miR-96水平患者血小板活化指標（±s）Table 3 platelet activation indexes in patients with different miR-126 and mir-96 levels（±s）

表3 不同miR-126、miR-96水平患者血小板活化指標（±s）Table 3 platelet activation indexes in patients with different miR-126 and mir-96 levels（±s）

組別高miR-126低miR-126 t 值P 值高miR-96低miR-96 t 值P 值n 84 42 80 46 CD62p（%）4.16±2.32 6.33±3.18 4.357＜0.001 6.29±2.53 4.31±2.02 4.539＜0.001 PAC-1（%）26.68±11.24 40.55±10.57 6.658＜0.001 41.08±9.56 27.46±10.71 7.366＜0.001 PAF（ng/mL）2.38±0.26 3.01±0.42 10.358＜0.001 2.99±0.37 2.31±0.33 10.323＜0.001

表4 miR-126、miR-96 與血小板活化指標相關性Table 4 correlation between miR-126，mir-96 and platelet activation index

2.4 不同miR-126、miR-96 水平患者90 d MACE發生率

低miR-126、高miR-96 患者90 d MACE 發生率高于高miR-126、低miR-96 患者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表5。

2.5 miR-126、miR-96與90 d MACE發生率相關性

Spearman 分析，90 d MACE 發生率與miR-126 呈負相關，與miR-96 呈正相關（r1=-0.853，P1＜0.001；r2=0.752，P2＜0.001）。

3 結論

miRNAs 是一類高度保守的內源性短序列非編碼小分子RNA，廣泛參與細胞增殖、發育、分化、凋亡、代謝等生理活動，其表達水平對生命體正常機能發揮及維持新陳代謝的動態平衡尤為重要。新近研究發現，miRNAs 是高血壓、心力衰竭、AMI 等心血管疾病的潛在生物學標記物，其中最受關注的是AMI［7］。周立賓等［8］指出，AMI 患者miR-126 表達量低于不穩定性及穩定性心絞痛患者。李翠如等［9］發現，AMI 早期血漿miR-126 變化顯著，可作為早期鑒別診斷AMI 標記物。可見不同類型冠心病患者循環血中miR-126 存在差異性，以AMI 患者變化最為顯著。miR-126 是目前唯一已知在內皮細胞系特異表達的miRNA，其可通過調節血管內皮病變、脂質代謝及促進血管形成等途徑參與AMI 發生發展［10］。本研究數據與上述研究結果相似。miR-96是微小RNA-183（miR-183）家族重要成員之一，其可通過調控腫瘤細胞分裂、凋亡基因參與腫瘤發生發展過程。隨臨床對miR-96 的研究不斷深入，彭國順等［11］學者對比急性冠脈綜合征、穩定性心絞痛及健康體檢者miR-96 水平變化，結果發現急性冠脈綜合征患者miR-96 水平明顯增高。Parahulevadeng 等［12］發現miR-96 在心肌梗死患者中存在異常表達，其機制可能與炎癥反應、血小板活化等原因有關。本研究結果進一步證實上述研究觀點，并為這一觀點的深入研究提供臨床證據。

表5 不同miR-126、miR-96 水平患者90 d MACE 發生率［n（%）］Table 5 incidence of mace at 90 days in patients with different miR-126 and mir-96 levels［n（%）］

AMI 發病與血小板活化密切相關，檢測體內有無血小板活化及其程度對本病鑒別診斷具有現實意義［13］。PAC-1 是GPIIb/IIIa 復合物纖維蛋白原受體，而GPIIb/IIIa 受體活性表達是導致血小板聚集最后通路，故檢測血小板表面PAC-1 表達能及時且準確反映血小板活化。CD62p 是依賴血小板活化的顆粒外膜蛋白，生理狀態下呈低表達或不表達，一旦血小板受刺激活化，便可與血小板膜融合，持久存在于血小板質膜表面。PAF 是目前發現最強血小板聚集誘導劑，可促進血小板活化與聚集。由此可見，PAC-1、CD62p、PAF 反映血小板活化途徑存在差異，三者共同檢測能更為準確反映血小板功能狀態。近年研究發現，miRNAs 在血小板基因調控期間起著關鍵作用，其可作用于靶mRNA，促使靶蛋白表達，以此調節血小板活化［14］。當前研究報道，冠心病患者血小板內存在大量miR-96，且血小板高反應者miR-96 表達水平是低反應者的2.6 倍，從側面證實miR-96 可通過參與血小板產生及激活過程影響AMI、心絞痛等冠心病發生發展［15］。由此推測，miR-126 表達上調是心肌梗死后血管新生恢復梗死組織血流供應的關鍵環節。

目前對miR-126、miR-96 與AMI 預后的相關研究略顯不足，故本研究對成功施行PCI 術的AMI 患者進行90 d 隨訪，記錄MACE 發生情況，結果發現兩者之前存在顯著相關性，可見AMI 患者miR-126、miR-96 水平與近期預后密切相關。推測原因為，miR-96、miR-126 可從不同途徑參與血小板活化，促進AMI 發生發展，進而影響預后改善。

綜上可知，AMI 患者外周血miR-126、miR-96水平顯著升高，且與血小板活化、近期預后相關性好，可作為鑒別診斷AMI 標志物，指導臨床治療。