非小細胞肺癌患者癌組織及血清中circRNA的表達水平及臨床意義

楊桄權 張千仕 范習剛 吳飛

肺癌作為一種惡性程度較高、發病率高居世界第一位的腫瘤疾病，在世界范圍內均為較嚴重的公共衛生問題，其中非小細胞肺癌（Non small cell lung cancer，NSCLC）占比最高［1］。肺癌在我國的發病率較高的原因在于未受控制的煙草消費、日益嚴重的環境污染和生活習慣改變，雖然疾病診斷和治療都有較大進步，但其發生、發展、轉移機制尚未明確，且早期診斷較為困難，因此患者5年生存率仍較低［2］。若能在肺癌患者早期予以確診并實施有效的治療方式，則可顯著延長患者生存期，提高生存質量［3］。組織病理學作為診斷金標準一般需通過手術或穿刺獲取靶組織，對患者有一定的生理、心理創傷，而臨床常見的血清腫瘤標記物在早期診斷方面缺乏足夠的靈敏度［4］。因此尋找創傷小、穩定性好、靈敏度高的新型生物標志物對NSCLC 的診斷和治療有積極意義。本研究旨在探討NSCLC 患者癌組織及血清中環狀RNA（circRNA）的臨床意義，為疾病診斷提供科學依據，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2019年12月于本院進行手術治療的56 例NSCLC 患者為研究對象。收集其中10 例患者的病理組織標本，要求癌組織經冰凍切片后組織HE 染色顯示癌細胞比例≧70%；取癌組織外緣5 cm 處的癌旁組織為對照組，要求染色后顯示不含癌細胞，且經免疫組化ABC 法染色為陰性。10 例患者中男性7 例，女性3 例；年齡（62.13±8.24）歲；肺鱗癌6 例，肺腺癌4 例；TNM 分期Ⅰ期4 例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期1 例；低度分化7 例，中度分化3 例；吸煙或戒煙者6 例，未吸煙者4例。余下46 例NSCLC 患者進行血清circRNA 檢測，其中男性32 例，女性14 例；年齡（60.48±9.15）歲，收集病理類型、臨床分期、分化程度、吸煙狀態等資料。按照1∶1 進行匹配，選擇46 例健康志愿者為對照組進行血清circRNA 檢測，均無惡性腫瘤疾病家族史，既往無放化療史，其中男性30 例，女性16 例；年齡（61.57±8.85）歲。NSCLC 組和對照組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

入組標準①年齡≧18 歲，性別不限；②經病理組織檢查確診為NSCLC；③術前血常規、心電圖、肝腎功能等檢查均達治療要求；④術前無嚴重合并癥，無手術禁忌癥；⑤患者自愿簽署知情同意書。排除標準①病理資料不全，TNM 分期不詳者；②合并其他惡性腫瘤者；③術前接受放化療治療者；④患者依從性差，不能配合研究者。

1.2 方法

1.2.1 癌組織和癌旁組織檢測

①使用TRIzol 試劑盒（美國Invitrogen 公司提供）分別提取10 例患者的癌組織和癌旁組織中的總RNA，測定RNA 在260、280、230 nm 處的吸光度值，計算濃度并估算純度，用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA 的純度和完整性。②使用RNaseR（美國Epicentre 公司提供）除去標本總RNA 中的線性RNA，采用Super RNA Labeling（美國Arraystar 公司提供）對RNA 進行cDNA 擴增和熒光標記。③將標記后的樣本和Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（美國Arraystar 公司提供）進行排列雜交，用清洗液試劑盒（美國Agilent 公司提供）進行清洗。④上海康成生物公司提供circRNA 芯片檢測、圖像采集、數據分析等。

1.2.2 血清檢測

采集肺癌患者和對照組對象清晨空腹肘靜脈血5 mL，離心分離血清保存，用TRIzol LS 試劑（美國Invitrogen 公司提供）提取血清總RNA，分光光度計測定RNA 濃度，將RNA 反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR，以2-ΔΔCt值表示目的circRNA 的相對表達水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 軟件進行數據分析，計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；采取受試者工作曲線（ROC）分析血清circRNA 對NSCLC 的診斷價值，記錄曲線下面積（AUC）；應用G2505C 基因芯片掃描儀（美國Agilent 公司提供）掃描組織標本Cy3 熒光強度，采用Agilent Feature Extraction software 進行數據分析，使用R 平臺對數據進行歸一化處理，對篩選出的差異表達circRNA 繪制火山圖，進行聚類分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 患者組織中circRNA 差異表達分析

R 平臺DESeq2 軟件篩選出癌組織和癌旁組織中差異表達顯著的circRNA 共181 個（Fold change≧2 或≦-2），差異有統計學意義（P＜0.05），繪制火山圖，其中117 個表達上調（紅色區域），64 個表達下調（藍色區域），見圖1。

圖1 circRNA 差異表達火山圖Figure 1 Volcano plot of circRNA differential expression

2.2 circRNA 聚類分析

根據各組標本circRNA 表達量的高低不同繪制聚類分析圖，圖中紅色表示circRNA 表達量相對高，綠色表示表達量相對低，差異表達的circRNA可明顯區分癌組織和癌旁組織，見圖2。

圖2 circRNA 差異表達聚類分析圖Figure 2 Cluster analysis of circRNA differential expression

2.3 NSCLC 患者血清circRNA 表達水平與臨床特征的關系

NSCLC 患者血清circRNA 表達水平與性別、年齡、吸煙狀態、分化程度、病理類型、臨床分期均無顯著相關性（P＞0.05），見表1。

表1 NSCLC 患者血清circRNA 表達水平與臨床特征的關系（±s）Table 1 Relationship between serum circRNA expression and clinical features in patients with NSCLC（±s）

表1 NSCLC 患者血清circRNA 表達水平與臨床特征的關系（±s）Table 1 Relationship between serum circRNA expression and clinical features in patients with NSCLC（±s）

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2.4 血清circRNA 對NSCLC 的診斷價值分析

NSCLC 組患者血清circRNA 表達水平明顯高于對照組（t=5.052，P＜0.05）。繪制ROC 曲線，結果顯示，血清circRNA 診斷NSCLC 的敏感度為80.43%，特異度為58.70%，AUC 值為0.752（95%CI：0.651～0.836），見圖3。

圖3 血清circRNA 診斷NSCLC 的ROC 曲線Figure 3 ROC curve of serum circRNA for NSCLC diagnosis

3 討論

肺癌是較為嚴重的公共衛生問題，臨床上十分重視對肺癌發生機制及診斷治療措施的研究，目前認為基因的表達和調控直接參與到惡性腫瘤的發生發展過程中［5］。人類基因組中超過90%的基因不具有編碼蛋白質的能力，可被轉錄成非編碼RNA（ncRNA），既往已有研究表明ncRNA 的異常表達能夠影響肺癌的發生和發展［6］。隨著高通量測序技術和生物信息學的不斷發展，哺乳動物體內發現大量內源性的circRNA，不僅擴充了ncRNA 家族的范疇，也被發現具備特定的生物學功能，可參與多種疾病的發生發展過程中，在多種類別腫瘤細胞（包括直腸癌、肺癌等）的克隆形成、增值、凋亡、侵襲、轉移過程中發揮重要作用［7-8］。

circRNA 作為一種具有特殊結構耐受核酸外切酶降解的內源性ncRNA，在人體細胞中表達廣泛、豐度高，多數在進化上存在高度序列保守性，結構穩定，具有組織特異性表達和時序特異性表達的特征［9］。ncRNA 多由外顯子環化形成，主要位于細胞質中，具備微小RNA（miRNA）反應元件，可與miRNA 結合阻礙其與mRNA 的靶點結合，抑制miRNA 功能，或參與調節miRNA 降低活性，從而在疾病中發揮重要作用［10］。火山圖分析發現差異表達顯著的circRNA 中有117 個表達上調，64 個表達下調，據此推測差異表達的circRNA多數在NSCLC 的發生發展過程中可能起到促癌作用。聚類分析結果顯示表達差異的circRNA 在癌組織和正常組織中表達有顯著差異，可用于區分NSCLC 癌組織和癌旁組織，對火山圖分析的結果有較好的補充作用。但本研究篩選的樣本數量較少，存在一定局限性，尚需進行大樣本的臨床研究和基礎研究加以證實，并進一步探討circRNA 在肺癌發生發展中的作用機制。

本研究結果推測circRNA 在疾病進展中有一定促進作用，與癌組織檢測結果相互印證，具有較高的可靠性。組織細胞壞死凋亡后的碎片通過囊泡釋放至血液中形成的循環游離RNA 被認為是血清circRNA 的主要來源，血清中囊泡存在circRNA 的富集［11］，分析認為circRNA 在癌組織和血清中的表達水平存在一定相關性，今后可針對血清circRNA 的來源問題進行進一步的研究。采取ROC 曲線結果顯示，該血清指標診斷NSCLC 的效能較高。分析認為，血清circRNA 具備作為NSCLC 無創性診斷標志物的潛質，結合癌組織檢測結果作出綜合判斷，可為未來NSCLC 的臨床診斷和靶向治療提供一定的參考。本研究對NSCLC患者血清circRNA 表達水平與臨床特征的關系進行了分析，結果表明，血清circRNA 水平與性別、年齡、吸煙狀態、分化程度、病理類型、臨床分期均無顯著相關性，可能與入組病例數過少有關，或與病例選擇存在偏倚有關。

綜上所述，NSCLC 癌組織和癌旁組織的circRNA 表達存在顯著差異，血清circRNA 對NSCLC有較好的診斷價值，circRNA 可能與疾病進展存在一定關聯。臨床應進一步深入研究circRNA 參與NSCLC 的發生發展過程及作用機制，為該疾病的早期診斷、靶向治療及預后評估提供新思路。