E6流式細胞儀檢測CD34+細胞百分比和絕對計數方法的建立

付笑迎 張小玲 劉夢桐 余閱 陳詩楊 彭冬 鄺雅賢 劉四喜 陳運生★

近年來，異基因造血干細胞移植術（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）在臨床廣泛應用，是目前唯一可以臨床治愈重型β-地中海貧血的方法，而供者外周血或骨髓中造血干細胞的數量對移植是否成功至關重要［1-4］，精確的造血干細胞計數可以幫助計算移植物中CD34+細胞的數量，作為判斷干細胞能否成功植入的有效指標［1，5，6］。20世紀80年代，CD34 分子被發現，CD34+細胞在正常骨髓單個核細胞中的比例約為1%～4%，在外周血中CD34+細胞的比例一般小于0.1%，因而造成測定結果的重復性和準確性均較差。準確計數CD34+細胞的數量，可判定動員方案是否成功，何時開始采集及時終止采集外周干，并可用于比較多個移植中心的療效［5］。1995年，血液病治療及移植國際聯合會成立了干細胞絕對計數小組，IHSAGE（International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE，國際血液治療與移植工程學會方案）方案于1996年問世，；之后BD 公司在ISHAGE 方案的基礎上又增加了DNA的熒光染料，推出ProCOUNT 方法［6-8］。本實驗室通過對應用邁瑞BriCyte E6 流式細胞儀建立檢測CD34+細胞百分比和絕對計數的方法并進行驗證。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2019年12月在深圳市兒童醫院血液腫瘤科確診為重型β-地中海貧血并行異基因造血干細胞移植患兒共89 例，HSCT 分為骨髓移植（Bone marrow transplantation，BMT）、外周血造血干細胞移植（Peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT）和臍血移植（Umbilical cord blood transplantation，UCBT），其中男性50例，女性49 例，年齡2～16 歲，7 例為無關相合供者（MUD），18 例為同胞相合供者（MSD），64 例為單倍型供者（MID）。移植前全面檢查患兒各重要臟器功能，患兒均無嚴重的基礎疾病或重要臟器功能不全，患者及其家屬充分知情并簽署知情同意書，移植方案經醫院倫理委員會批準。

1.2 供者外周血或骨髓干細胞動員

G-CSF（粒細胞集落刺激因子）為目前推薦使用的細胞因子，皮下或靜脈注射，推薦劑量為10 μg/kg/d，可分2 次或單次給藥，連用5 天。血細胞分離一般在動員的第5 天進行，即使應用G-CSF 動員，外周血干細胞數量在地貧供者中仍有較大的個體差異。目前中華骨髓庫推薦的目標采集量為MNC（單個核細胞）數＞5×108/kg 且CD34+細胞數＞2×106/kg，或根據方案確定目標細胞數［9］。

1.3 流式細胞術測定CD34+細胞百分比和絕對計數

1.3.1 標本采集

1 mL 注射器采集肝素抗凝骨髓混懸物或外周靜脈血1 mL，新鮮樣本白細胞手工計數標本在1 小時內進行樣本處理；流式標本在12 小時之內進行樣本處理，樣本標記前室溫20～25℃保存，標記完后2～8℃保存。

1.3.2 免疫熒光染色

對照管：CD45-FITC（5 μL）/IgG1-PE（10 μL）；測試管：CD45-FITC（5 μL）/CD34-PE（10 μL），流式抗體均來自中國同生時代。當白細胞計數5 ×109/L＜N＜50×109/L 時，無需稀釋樣本；當白細胞計數N＞50×109/L 時，先將全血標本稀釋10 倍，對照管和測試管分別加入100 μL 血樣本；為保證加樣量準確，采用反式加樣法，充分混勻，室溫避光孵育15 分鐘后，加入1×流式細胞分析用溶血劑（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）400 μL，室溫避光孵育15 min，免洗，即刻上機分析，手動模式上樣，低速獲取細胞，收集單個核細胞8 萬個。處理后的樣本信息在BriCyte E6 流式細胞儀上使用客戶端軟件MRFlow 進行分析。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計學處理，計量資料用（±s）表示，符合正態分布的兩組之間比較采用t檢驗；兩個連續變量之間的相關性采用Pearson 相關分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應用E6 流式細胞儀設定ISHAGE 法測定CD34+細胞百分比和絕對計數的模版

共建立5 個散點圖，按照ISHAGE 進行邏輯設門，最終計算出CD34+細胞的百分比和絕對計數：CD34+細胞百分比為0.38%，CD34+細胞絕對計數為1633 個/μL。見圖1。

圖1 ISHAGE 法模版計數1 例移植患兒供者動員后的外周血標本Figure 1 CD34+cells counted by ISHAGE method by flow cytometry in a donor of transplantation

2.2 “流式直接體積法”計數CD34+細胞絕對計數與雙平臺計算CD34+細胞絕對計數相關性分析

經Pearson 相關性分析顯示，第一次CD34+細胞計數時，兩種方法的Pearson 相關系數為0.930 9，R2=0.87，95%CI為0.894 3～0.955 1，P＜0.0001，顯著相關；第二次CD34+細胞計數時，兩種方法的Parson 相關系數為0.93，R2=0.86，95%CI為0.888 0～0.952 1，P＜0.000 1，亦顯著相關。圖2。

2.3 兩次外周血樣本白細胞（WBC）手工計數和CD34+細胞流式計數的相關性分析

圖2 比較兩種計數方式計數CD34+細胞絕對計數的相關性Figure 2 The correlation between the 2 counting methods to analyze the absolute count of CD34+cells

兩次手工計數白細胞的Pearson 相關系數為0.95，R2=0.90，95%CI為0.922 9～0.967 4，P＜0.000 1；兩次手工計數單個核百分比Pearson 相關系數為0.97，R2=0.95，95%CI為0.961 9～0.984 1，應用Pearson 比較相關性，兩次手工計數的白細胞數和單個核細胞百分比高度一致且相關，差異有統計學意義（P＜0.05）。同時分析了兩次CD34+細胞流式計數的相關性，兩次CD34+細胞計數的百分比Pearson 相關系數為0.96，R2=0.92，95%CI區間為0.934 7～0.972 5，P＜0.000 1；兩次CD34+細胞絕對計數的Pearson 相關系數為0.91，R2=0.83，95%CI區間為0.866 1～0.942 3，亦高度相關并一致，差異有統計學意義（P＜0.005）見圖3，4。

圖3 兩次外周血白細胞手工計數和分類的相關性Figure 3 The correlation between two manual counts and phenotype of peripheral blood white blood cells

圖4 兩次外周血流式計數CD34+細胞的相關性Figure 4 The correlation between two peripheral blood flow cytometry counts of CD34+cells

2.4 不同移植方式時CD34+造血干細胞百分比和絕對計數的比較分析

骨髓中親緣全相合組CD34+造血干細胞的百分比高于單倍體組（P＜0.05）；外周干的CD34+造血干細胞計數顯示，親緣全相合組的CD34+造血干細胞的百分比和絕對計數均高于于單倍體組，外周血采集物中CD34+造血干細胞百分比及絕對計數由高到低的排列為非親緣全相合組＞單倍體組＞親緣全相合組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 流式細胞術計數骨髓及外周血中CD34+造血干細胞（±s）Table 1 CD34+hematopoietic stem cells counting in bone marrow and peripheral blood by flow cytometry（±s）

表1 流式細胞術計數骨髓及外周血中CD34+造血干細胞（±s）Table 1 CD34+hematopoietic stem cells counting in bone marrow and peripheral blood by flow cytometry（±s）

注：親緣全相合組&單倍體組：aP＜0.05。

非新緣全相合組親緣全相合組單倍體組骨髓百分比（%）0.39±0.21a 0.22±0.11絕對計數（個/μL）121±52 98±56外周干，第一次百分比（%）0.71±0.37 0.45±0.20a 0.63±0.31絕對計數（個/μL）3197±1153 1710±647a 2375±1208外周干，第二次百分比（%）0.46±0.21a 0.61±0.30絕對計數（個/μL）1661±608a 2373±1203

3 討論

外周血造血干細胞移植近年來已經被廣泛應用開展，正常外周血中造血干細胞濃度很低，應用G-CSF 進行外周血干細胞動員后，外周血造血前體細胞濃度顯著增加，但這種情況維持時間短暫，故準確計數CD34+細胞的數量，可判定動員方案是否成功，何時開始采集及何時終止采集外周干［10-11］。用流式細胞術計數臍帶血，外周血及骨髓等樣本中CD34+細胞的方法已被普遍采用。然而，不同實驗方法之間計數CD34+細胞的百分比和絕對計數的方法存在效大的變異性，由于CD34+細胞在骨髓，臍帶血或被動員后的外周血中含量很低，因而造成測定重復性和準確性均很差，如何準確地計數CD34+細胞的絕對計數，是本實驗室關注的關鍵性問題［12-14］。

影響流式計數CD34+細胞結果的主要因素包括：①標本制備過程是否分離PBMCs 和洗滌細胞：進行PBMCs 分離及進行洗滌均會丟失部分細胞，造成實驗誤差［5］。因此本實驗室建立的檢測方法為全血標本檢測，紅細胞溶解劑溶血15 min 后免洗，直接上機檢測，整體流程僅需1 小時左右，即可得到CD34+細胞的百分比和絕對計數結果，及時為臨床干細胞采集提供干細胞計算依據。②CD34+抗體熒光的選擇：由于藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）的發射光強，發射光峰值在580 nm 與細胞的自發熒光相互干擾小，因此本方案中采用PE 標記CD34，FITC 標記CD45，并應用BriCyte C6流式細胞儀的自動熒光補償調節熒光補償。③數據獲取及分析方案：不同的方案獲取細胞數不同，一般來說，收集細胞數目越多，結果越準確，本方案采用低速收集8 萬個單個核細胞，分析方案采用1994年由Sutherland 等提出的ISHAG 方案，使用CD34-PE，CD45-FITC，SSC 和FSC 4 個參數，其中CD45 主要表達于白細胞表面，在不成熟的造血干細胞表達強度較弱，且不表達于血小板，紅細胞和細胞碎片，因此利用CD45 設門可以去掉血小板、紅細胞和碎片的干擾［6］。邁瑞BriCyte E6 流式細胞儀提供全方位多角度智能化自動軟件，可以直接測量樣本體積，因此無需在樣本中額外添加參比的熒光微球，即可獲得樣本中細胞的絕對計數結果，本實驗應用“流式直接體積法”實現單平臺同時檢測CD34+細胞百分比和絕對計數。與經典的BD 流式細胞儀的ProCOUNT 方法相比，本實驗方法更簡便易行，實驗成本更低［15］。有研究顯示，基于體積和基于參比微球的兩種單平臺測量方法，不僅在CD3+CD4+細胞檢測上具有較高的相關系數和較低的偏差，而且在其他淋巴細胞亞群的檢測上也體現了良好的一致性［16］?，F行的造血干細胞計數的另一種方法是Sysmex XN 血液分析儀上的全自動干細胞（HPC）計數，但與本方法相比，其儀器設備及實驗成本均較高［17］。

綜上所述，準確計數CD34+細胞的絕對計數對移植物的成功植入至關重要，“直接體積計算法”計數CD34+細胞絕對計數的方法操作簡便，結果可信，且測試成本更低，對于改善國內基層醫院及發展中國家的診療水平具有重要意義。