采用二代測序?qū)arfan綜合征家系進行植入前遺傳學診斷

何天文 盧建 陳創(chuàng)奇 劉頓 丁紅珂 董云巧 杜麗 尹愛華★

Marfan 綜合征（Marfan syndrome，MFS）是一種累及全身結(jié)締組織的常染色體顯性遺傳性病，其臨床病變最常累及骨骼、眼與心血管系統(tǒng)［1］。大多數(shù)MFS 患者具有家族史，編碼微纖維蛋白（fibfillin.1，F(xiàn)BN1）的缺陷或突變是其主要致病原因。人群發(fā)病率為0.02%～0.03%，其中25%～30%病例為散發(fā)的，考慮可能是親代生殖細胞突變所致，其后代患病風險為50%［2-6］。目前對MFS 出現(xiàn)癥狀進行對癥治療，并無針對MFS 的有效根治方法［7］。通過植入前遺傳學診斷和產(chǎn)前診斷可以預防MFS 患兒出生。二代測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)作為胚胎植入前遺傳學診斷（preimplataion genetic dignosis，PGD）的新檢測手段，不僅能檢測染色體非整倍性、染色體結(jié)構(gòu)異常以及單基因疾病，而且精度高［8］。本研究對1 個MFS 家系進行外顯子捕獲測序篩查FBN1基因突變，通過Sanger 測序驗證結(jié)果。明確FBN1基因致病突變后，采用NGS 對突變位點的直接測序和致病基因連鎖單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位點連鎖分析進行PGD，以避免妊娠MFS 胎兒。

1 資料與方法

1.1 研究對象

患者（Ⅱ：2）男，32 歲，輕微漏斗胸，扁平足，手腳趾修長，皮下脂肪層很薄，心功能Ⅱ級，因主動脈弓夾層曾行主動脈根部置換術(shù)治療。患者父母（Ⅰ∶1，Ⅰ∶2）非近親結(jié)婚，均未見明顯異常；患者妻子（Ⅱ∶1）33 歲，表型正常，無家族史（圖1），G1P0A1，于2014年發(fā)生早期自然流產(chǎn)1 次，沒有對流產(chǎn)物進行相關(guān)的遺傳學檢查。為了避免妊娠患兒，該夫婦于2016年10月在廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心和生殖醫(yī)學中心就診咨詢要求行PGD。該夫婦充分了解PGD 治療過程及相關(guān)風險后簽署知情同意書。本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院生殖醫(yī)學倫理委員會批準。

圖1 Marfan 綜合征家系圖Figure 1 Marfan syndrome pedigree

1.2 主要試劑與儀器

全基因組擴增試劑盒、胚胎植入前單基因病檢測建庫試劑盒、胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒（北京中儀康衛(wèi)醫(yī)療器械有限公司，中國北京），Verity 梯度PCR 儀、ABI3730 測序儀（ABI 公司，美國），MiSeq 高通量測序（Illumina 公司，美國）

1.3 方法

1.3.1 標本采集及基因組DNA 提取

抽取Ⅰ∶1、Ⅰ∶2、Ⅱ∶1、Ⅱ∶2 的EDTA 抗凝外周血各2 mL，提取外周血基因組DNA。采用天根生化科技有限公司的磁珠法血液基因組提取試劑盒（DP329）進行提取，按照試劑盒說明書進行提取操作。

1.3.2FBN1基因突變篩查及驗證

對Marfan 綜合征家系成員Ⅰ∶1、Ⅰ∶2、Ⅱ∶1、Ⅱ∶2 進行外顯子捕獲測序篩查FBN1基因突變位點。檢測到的致病突變位點進行Sanger 測序驗證，用Oligo6 軟件設(shè)計針對致病位點的特異性引物，擴增后用ABI3730 遺傳分析儀進行檢測。對ABI3730 遺傳分析儀檢測生成的ab1 文件，用Seq-Man 軟件進行分析，判定NGS 檢測到的致病突變位點是否真實存在。

1.3.3 患者夫婦單體型的構(gòu)建

以FBN1基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界為目標區(qū)域，在該基因上下游2M 區(qū)域內(nèi)選擇100 個高密度緊密連鎖的SNP 作為遺傳連鎖標記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER 網(wǎng)站設(shè)計引物，經(jīng)DNA 純化、建庫、二代測序后，選擇有效位點進行構(gòu)建單體型。

1.3.4 胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢

取卵后進行卵細胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）授精，受精卵轉(zhuǎn)人分裂期胚胎培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎發(fā)育第3 天用激光脈沖在透明帶上切割一直徑約20 μm 的裂口，將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育第5 天（D5）或第6 天（D6）觀察到囊胚形成且脫出裂口滋養(yǎng)層細胞數(shù)在2～9 個時進行活檢。活檢時用固定針吸吹胚胎，用活檢針吸取脫出裂口的滋養(yǎng)層細胞，取出的滋養(yǎng)層細胞吹入活檢液中，在PBS 液滴中清洗后轉(zhuǎn)入PCR 反應(yīng)管中。活檢的囊胚編號后進行玻璃化冷凍處理，待遺傳學檢查完成后再行解凍移植。

1.4 植入前遺傳學診斷

對活檢獲得的囊胚滋養(yǎng)層細胞進行基于等溫多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）技術(shù)的全基因組擴增。擴增成功的樣本行多重PCR 擴增單體型目標區(qū)域，產(chǎn)物純化建庫后NGS。通過NGS 對FBN1基因突變位點直接測序和致病基因連鎖SNP 位點連鎖分析進行PGD。利用Sanger 測序進一步驗證NGS 結(jié)果。針對結(jié)果顯示不攜帶致病突變的胚胎進行了低深度的染色體非整倍性篩查，以排除有攜帶染色體拷貝數(shù)異常的胚胎。

1.5 產(chǎn)前診斷

選擇PGD 結(jié)果顯示不攜帶致病突變的且發(fā)育良好的胚胎于凍融胚胎周期進行移植。于胚胎移植后14 d 查血HCG 確定是否妊娠，于胚胎移植后4周行經(jīng)陰道B 超確定是否臨床妊娠，于孕18～24 周時行羊膜腔穿刺進行產(chǎn)前診斷驗證PGD 結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 突變篩查及驗證

通過二代測序和分析，該家系成員未發(fā)現(xiàn)FBN1基因各外顯子存在大片段缺失或重復，患者（Ⅱ∶2）在FBN1基因上發(fā)現(xiàn)1 個剪切位點突變c.247+1 G＞A，為雜合子，該突變位點在數(shù)據(jù)庫中有疾病相關(guān)性報道。患者父母（I∶1，I∶2）及患者妻子（Ⅱ∶1）均未檢出突變，該突變通過Sanger 測序進行驗證。見圖2、表1。

圖2 患者（Ⅱ∶2）FBN1 基因c.247+1 G＞A 突變Sanger測序圖Figure 2 Sanger sequence diagram of c.247+1 G＞A mutation of FBN1 genec in patients（Ⅱ∶2）

表1 家系FBN1 基因突變篩查及驗證結(jié)果Table 1 Screening and validation results of FBN1 gene mutation in family

2.2 夫婦單體型的構(gòu)建

以FBN1基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界為目標區(qū)域，在該基因上下游2M 區(qū)域內(nèi)選擇100 個高密度緊密連鎖的SNP 作為遺傳連鎖標記，經(jīng)過NGS 后，選擇有效位點進行單體型分析。患者夫婦有效SNP 位點數(shù)和分布。見表2。

表2 患者夫婦有效SNP 位點數(shù)和分布Table 2 number and distribution of effective SNP in couples

2.3 胚胎培養(yǎng)及胚胎活檢

獲卵20 個，其中成熟卵子17 個，予以ICSI 后正常受精15 個，所有正常受精卵均發(fā)生卵裂，D5觀察有5 枚囊胚符合活檢標準，活檢產(chǎn)物標記為D501、D502、D503，D6 觀察有2 枚囊胚符合活檢標準，產(chǎn)物標記為D601、D602，每個樣本活檢細胞數(shù)約2～9 個細胞。活檢后進行胚胎玻璃化冷凍保存。

2.4 植入前遺傳學診斷

對活檢獲得的囊胚滋養(yǎng)層細胞分別進行全基因組擴增。擴增成功的樣本行多重PCR 擴增單體型目標區(qū)域，產(chǎn)物純化建庫后NGS。利用Sanger 測序進行進一步驗證，結(jié)果與NGS 結(jié)果一致。由于該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，結(jié)合胚胎的該突變NGS 結(jié)果和Sanger 測序結(jié)果再進行單體型連鎖分析，結(jié)果顯示D5 的3 個胚胎中2 個為正常胚胎，D6 的2 個胚胎中1 個為正常胚胎。見表3、表4。

表3 FBN1 基因c.247+1G＞A 突變植入前遺傳學診斷結(jié)果Table 3 Preimplantation genetic diagnosis results of c.247+1G＞A mutation of FBN1 genec

表4 胚胎單倍型連鎖分析結(jié)果Table 4 results of haplotype linkage analysis

2.5 等位基因脫扣率（allele drop-out，ADO）分析

五個活檢胚胎的致病突變位點（chr15：48905206）沒有發(fā)生脫扣。統(tǒng)計五個活檢胚胎的致病突變位點和47 個SNP 位點的脫扣等位基因數(shù)，得出復合ADO 率為11.25%。

2.6 胚胎移植及產(chǎn)前診斷

選擇遺傳學檢測正常且發(fā)育良好的胚胎（D501）在患者妻子的第3個月經(jīng)周期行囊胚解凍移植。移植后14 d 檢測外周血hCG 為1 044 mIU/mL；移植后40 d 經(jīng)陰道超聲見單個孕囊，孕囊大小約18 mm～13 mm，胚芽長約4 mm，可見心管搏動。孕19 周經(jīng)羊膜腔穿刺進行產(chǎn)前診斷證實為健康胎兒。孕40 周剖宮產(chǎn)分娩一正常男嬰，體重3 100 g，健康狀況良好。

3 討論

MFS 具有高度表型異質(zhì)性，不同家系患者有不同器官、不同程度的損害，甚至同一家系中不同患者也可能有不同器官、不同程度的損害［9］。FBN1基因定位于15q21.1，全長235 kb，含65 個外顯子，編碼序列為10 kb［10］。產(chǎn)前診斷是預防單基因遺傳病患兒出生的主要手段。以羊膜腔穿刺術(shù)為主的傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷技術(shù)不但具有有創(chuàng)性，還具有一定的導致孕婦流產(chǎn)的風險。經(jīng)產(chǎn)前診斷后確診胎兒為MFS 后，孕婦需要終止妊娠，對孕婦本人及其家庭也造成一定的生理和心理負擔。PGD 指的是從體外受精第3日的卵裂球取1～2 個細胞或第5、6日的囊胚取5～10 個外滋養(yǎng)層細胞，進行遺傳學分析后，選擇正常胚胎移植母體子宮，避免異常胚胎妊娠的發(fā)生，從源頭避免遺傳性缺陷胚胎的種植。把產(chǎn)前診斷推進到孕前診斷，將遺傳病的預防提前到胚胎階段，與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷具有明顯的優(yōu)勢，避免可能的治療引產(chǎn)給母體帶來生理和心理的創(chuàng)傷［11-12］。

1996年，Harton GL 等人通過巢式PCR 技術(shù)對Marfan 進行了第一次植入前基因檢測治療［13］。隨著基于等溫多重置換技術(shù)的全基因組擴增（Whole genome amplification，WGA）技術(shù)的發(fā)明［14］，克服了單細胞水平基因檢測DNA 模板量過少的問題，極大地提高了檢測結(jié)果的準確性以及單細胞分析的可靠度。2006年，Belén L 等研究者評價了MDA-PGD 在Marfan 中的應(yīng)用［15］。以上研究均需要對單個特定基因的特定變異位點進行設(shè)計和優(yōu)化后檢測，是耗時耗力的工作。NGS 技術(shù)的發(fā)明，實現(xiàn)了一次性對上百萬條DNA 進行測序，縮短了耗費時間，遺傳性疾病的診斷率和分辨率邁入新的高度，給PGD 技術(shù)帶來了革命性的改變。患者（Ⅱ：2）攜帶FBN1基因1 個剪切位點突變c.247+1G＞A，為雜合子，已有該突變位點在數(shù)據(jù)庫中有疾病相關(guān)性報道［16］。明確致病突變位點后，采用NGS 對突變位點的直接測序和致病基因連鎖SNP 位點連鎖分析進行PGD。以FBN1基因編碼區(qū)及外顯子-內(nèi)含子交界為目標區(qū)域，在該基因上下游2M 區(qū)域內(nèi)選擇100 個高密度緊密連鎖的SNP 作為遺傳連鎖標記，可很大程度上減少因重組導致的檢測不完全。該Marfan 家系中患者父母（I∶1，I∶2）及患者妻子（Ⅱ∶1）均未檢出突變，該突變?yōu)榛颊咝掳l(fā)致病突變，不能通過分析患者父母的單倍型確定攜帶致病突變的風險染色體。因此該家系要盡量多送檢胚胎，通過結(jié)合胚胎的該突變NGS 結(jié)果和Sanger 測序結(jié)果以及胚胎的單體型才能確定攜帶致病突變的風險染色體。通過致病基因連鎖SNP 位點連鎖分析和突變位點的直接測序結(jié)果提高PGD 結(jié)果的準確性。由于胚胎活檢所得細胞數(shù)很少，必須進行WGA，而WGA 會增加檢測結(jié)果擴增不均勻或等位基因脫扣的風險。WGA 是NGS 在PGD 和植入前遺傳學篩查（preimplantation genetic screenin，PGS）臨床應(yīng)用的關(guān)鍵一步，其高度均一性和保真度是PGD 和PGS 結(jié)果準確的必要條件。NGS 具有高通量、高并行性和高分辨率等特性，可以提供高深度的多位點多基因分析，結(jié)合致病基因連鎖SNP 位點，可以避免由ADO 帶來的檢測錯誤［17］。