乳桿菌發酵葛根水提液工藝研究及其解酒功效探討

陳艷艷，于 波，潘黛安，陳靜靜，王思明，白雪媛

（長春中醫藥大學 吉林省人參科學研究院，吉林 長春130117）

葛根（Puerariae lobatae Radix）是多年生豆科植物野葛的干燥塊根，是國家衛生部批準的藥食兩用植物[1-2]。中藥葛根歷史悠久，最早記載于《神農本草經》，后據《中國藥典》及《中華本草》等資料記載，葛根具有解酒的功效[3-4]，是古代文獻記載和現代研究證實解酒功效比較明確的中藥。葛根除富含淀粉、膳食纖維、17種氨基酸和大量礦質元素外，主要活性成分為總黃酮中的異黃酮，研究證實葛根中含30多種異黃酮物質，另含多糖、生物堿、三萜皂甙等功能活性成分，具有抑制脂質過氧化，清除體內自由基，抗氧化，預防心腦血管疾病，提高免疫力，降血糖，調節血脂，改善骨質疏松，調節雌激素水平，調節血壓，益智和美容等藥理保健功能[5-9]。

大量研究證實，酒精進入人體后的代謝是一系列氧化還原過程，乙醇代謝相關酶的作用至關重要，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）及其亞型等，還原酶等增多可加快乙醇的氧化代謝速率，加速其還原成乙酸進而排出體外[10-12]。

我國早在1 000多年前就已將微生物發酵的方法應用于中藥炮制當中，成為最早利用微生物轉化天然藥物的國家[13]，利用微生物發酵得到的中藥成分更易于吸收，而且能達到減毒增效的作用[14]。微生物發酵中藥能提高有效成分的含量，產生新化合物及減少不良反應，促進有效成分吸收和利用，是現代生物技術與中醫藥相結合的理想途徑[15-16]。CHOI Y等[17]研究發現，短雙歧桿菌發酵后的葛根在改善葡萄糖和脂代謝相關途徑方面更有效，發酵過程提高了乳酸含量，并促進了某些微生物群落的富集，從而有助于抗肥胖和抗炎活動。

該研究用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）混合發酵技術，考察發酵對葛根抗氧化成分及解酒功效的影響，為葛根成為更高效解酒食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根飲片、56°牛欄山二鍋頭、力克保健液：市售；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉（均為分析純）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：CGMCC 1.568、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）CGMCC 1.2468：中國普通微生物菌種保藏管理中心。MRS肉湯培養基：北京索萊寶科技有限公司。天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒：南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司。

清潔級美國癌癥研究所（institule of cancer researcch，ICR）小鼠：雄性，體質量（20±2）g，購自長春億斯實驗動物技術有限公司。飼養環境溫度為（23±2）℃，相對濕度為40%～60%，明暗交替周期為12 h。

1.2 儀器與設備

SX-700蒸汽滅菌器：日本Tomy Digital Biology公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；innova 40搖床：德國Eppendorf公司；UV-2550型紫外可見光度計：日本島津公司；KQ-600E型超聲清洗器：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根提取液的制備

精密稱定葛根飲片，以1∶10（g∶mL）料液比加蒸餾水→沸騰后轉小火，1.5 h/次，煎煮兩次→3 500 r/min離心10 min后過絹布→濃縮至生藥質量濃度為0.1 g/mL→分裝，高溫高壓滅菌鍋121 ℃滅菌60 min→晾涼至室溫，取一份4 ℃冷藏保存，設為葛根水提液對照組，其余備發酵。

1.3.2 乳酸菌發酵方法

采用兩步培養法培養，取甘油凍藏的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌，4 ℃解凍，置紫外消毒30 min后的超凈臺中，取40 μL解凍菌液置于4 mL滅菌后的MRS培養基中，37 ℃，180 r/min培養24 h后得一級活化液，再取1 mL一級活化液置100 mL滅菌后的MRS培養基中，37 ℃、180 r/min培養24 h活化完成。按單因素試驗及正交試驗所需不同接種量，接種至滅菌后的葛根提取液中，搖床37 ℃，180 r/min條件下發酵試驗所對應不同時間[14]。

1.3.3 單因素試驗

以初始pH值為6.0、接種量為3%、發酵時間為48 h、接種比例（植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1）為基礎條件，在固定其他因素條件下逐一進行單因素試驗，考察不同初始pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%），發酵時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h），植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比例（1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1）對SOD酶活性的影響。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以初始pH值（A）、接種量（B）、發酵時間（C）、植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌接種比例（D）為試驗因素，以SOD活性（R）為評價指標，采用L9（34）正交設計試驗，因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 解酒防醉實驗

取健康ICR雄性小鼠28只，適應性飼養3 d后，隨機分為模型組、力克陽性對照組、葛根發酵液組、葛根水提液組，禁食不禁水12h后，各給藥組給予相應藥物灌胃（0.15mL/10g），模型組給予生理鹽水0.15 mL/10 g。30 min后，各組小鼠灌胃給予56°牛欄山二鍋頭（0.15 mg/10 g），觀察小鼠醉酒潛伏期（灌酒到翻正反射消失時間）、醒酒時間（翻正反射消失到翻正反射恢復時間）[16]。

1.3.6 生物指標檢測

（1）預處理

取健康ICR雄性小鼠35只，適應性飼養3 d后，隨機分為陰性對照組、模型組、力克陽性對照組、葛根發酵液組、葛根水提液組，每天給予陰性對照組和模型組生理鹽水0.15 mL/10 g灌胃，其他組給予0.15 mL/10 g相應藥物，30 min后，除陰性對照組灌胃生理鹽水外，其他組給予56°牛欄山二鍋頭0.08 mL/10 g，連續8 d。末次給藥30 min后，除陰性組外給予56°牛欄山二鍋頭0.1 mL/10 g。給酒后半小時摘眼球取血，脫椎處死，解剖取肝臟，用預冷生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干水分，液氮冷凍備用[17-18]。

（2）血清AST、ALT檢測

摘眼球取血于離心試管中，3 000 r/min離心10 min，取上清，參照試劑盒方法測定血清中天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）含量。

（3）肝臟中SOD活力檢測

采用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（WST-8）法，參照試劑盒說明書，準確稱取組織質量，按照質量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清即10%勻漿上清待測。通過預實驗將10%組織勻漿上清用生理鹽水稀釋成適當濃度后參照操作表操作后，37 ℃孵育20 min，于450 nm處測定各復孔吸光度值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 初始pH對SOD活力的影響

圖1 初始pH值對SOD活力的影響Fig. 1 Effect of initial pH value on SOD activity

由圖1可知，SOD活力隨初始pH的升高呈先升高再降低的趨勢，在pH為6.0時達到峰值。推測原因為可能是，弱酸性條件下乳酸菌的生長繁殖及次級代謝產物的產生較快，強酸以及偏堿性環境均不利于乳酸菌的生長繁殖及代謝。因此，試驗最佳初始pH值為6.0。

2.1.2 乳酸菌總接種量對SOD活力的影響

圖2 接種量對SOD活力的影響Fig. 2 Effect of inoculum on SOD activity

由圖2可知，SOD活力在總接種量在2.5%之前逐漸上升，在2.5%達到峰值，隨后呈下降趨勢，推測在空間物質充裕的情況下，乳酸菌代謝活動與菌密度呈正比，但當乳酸菌密度過高時，乳酸菌的代謝活動因空間、營養物質等因素減緩。因此，試驗最佳接種量為2.5%。

2.1.3 發酵時間對SOD活力的影響

圖3 發酵時間對SOD活力的影響Fig 3 Effect of fermentation time on SOD activity

由圖3可知，SOD活力在48 h內隨發酵時間基本呈上升趨勢，48 h達到峰值，推測在48 h內乳酸菌處于生長代謝旺盛期，48 h以后隨著乳酸菌的密度增高和衰老轉而消耗營養產物，使得次級代謝產物減少，SOD活力降低。因此，試驗最佳發酵時間為48 h。

2.1.4 接種比例對SOD活力的影響

接種比例對SOD活力的影響如圖4所示，結果表明，植物乳桿菌與副干酪乳桿菌比例過高或者過低時，SOD活力都比較低，植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1時，SOD活力最高，因此選用植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1為最佳接種比例。

圖4 接種比例對SOD活力的影響Fig. 4 Effect of inoculation ratio on SOD activity

2.2 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以初始pH值、接種量、發酵時間、植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比例為評價因素，以SOD活力為評價指標進行正交試驗，試驗結果與分析見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2 發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2正交試驗結果極差分析可知，各因素對SOD活力影響次序為A＞C＞B＞D。由表2可知，最佳發酵工藝為A1B3C3D3。遂發酵工藝條件為A1B3C3D3不變，即初始pH5.5，接種量4%，接種比例（植∶副）2∶1，發酵48 h。由表3方差分析結果可知，A、C因素對結果均有顯著性影響（P＜0.05），B、D因素對結果無顯著性影響（P＞0.05）。

2.3 驗證試驗

在上述最佳條件下，進行平行試驗5次，SOD活力值依次為：4.06 U、4.09 U、4.05 U、4.11 U、4.08 U，平均值為4.08 U，相對標準偏差為0.585%。由此可得此試驗設計合理。

2.4 解酒防醉實驗

表4 小鼠解酒防醉實驗結果Table 4 Results of hangover and anti-drunk experiment of mice

由表4可知，與模型組相比，葛根水提液組醉酒潛伏期顯著延長、醉酒時間顯著縮短（P＜0.05），葛根發酵液組與陽性組醉酒潛伏期極顯著延長（P＜0.01），醉酒時間極顯著縮短（P＜0.01），且葛根發酵液組防醉解酒效果強于水提液組（P＜0.05）。

2.5 血清AST、ALT活力檢測

小鼠血清AST、ALT活力檢測結果如圖5所示。給藥8 d后，與陰性組相比，模型組血清ALT和AST活力極顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，陽性組、葛根水提液組、葛根發酵液組小鼠血清AST、ALT活力顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。并且葛根發酵液組作用優于水提液組（P＜0.05）。

圖5 小鼠血清AST、ALT含量檢測結果Table 5 Determination results of AST and ALT contents in mice serum

2.6 肝臟SOD活力檢測

肝臟SOD活力檢測結果如圖6所示，與陰性組相比，模型組小鼠肝臟SOD活力極顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，陽性組、葛根發酵液及水提液組小鼠肝臟SOD活力極顯著上升（P＜0.01）。且葛根發酵組優于水提液組（P＜0.05）。

圖6 小鼠肝臟SOD活力檢測結果Fig. 6 Determination results of SOD activity in mice liver

3 結論

本試驗通過植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發酵，研究了葛根水提液乳桿菌發酵前后抗氧化活性、對小鼠解酒防醉效果以及酒精性肝損傷的保護作用的變化。通過正交試驗，得到葛根水提液的最佳發酵工藝為初始pH5.5，接種量4%，接種比例（植∶副）2∶1，發酵時間48 h，較對照組及發酵前抗氧化成分SOD活性均升高，一定程度上延長小鼠醉酒潛伏期并縮短醉酒時間（P＜0.05或P＜0.01），緩解了肝損傷引起的小鼠血清中AST、ALT活力升高，并提高小鼠肝臟SOD活力。綜上所述，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌雙菌發酵可提高葛根的抗氧化能力及對小鼠急性醉酒的解酒防醉能力，增強小鼠肝臟的抗氧化能力，并且可一定程度上對小鼠酒精性肝損傷起保護作用。